Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki

Apresentação em tema: "Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki"— Transcrição da apresentação:

1 Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki
Abelhas sem ferrão no monitoramento de resíduos de pesticidas e qualidade do mel Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki

2 Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais
São responsáveis por até 90% da polinização em áreas naturais O que acontece se esses insetos se contaminam com pesticidas ou outros compostos xenobióticos? O que acontece com a sua cria, o ninho, a colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?

3 Relatos de casos de sumiço de abelhas nativas sem ferrão – Paraná
Será que os pesticidas, em especial inseticidas podem estar relacionados com esse sumiço? Caixa abandonada de Leurotrigona muelleri Cambé-PR Caixa abandonada de Plebeia droryana Cambé-PR

4 Esse desaparecimento de abelhas sem ferrão está muito parecido com a Desordem do Colapso das Colônias (CCD) descrita para as abelhas Apis mellifera – primeiro relato em outubro de 2006 na costa leste dos EUA CCD - ausência de abelhas vivas ou morta na colônia, mas com a presença de crias e alimento, podendo ser encontrado, em alguns, uma pequena quantidade de operárias e a rainha dentro da colmeia. Em colmeias em há operárias observa-se uma relutância da colônia em consumir o alimento energético ou proteico fornecido. Prováveis causas da CCD em A. mellifera: uma nova doença que acomete as abelhas – parasita ou patógeno envenenamento por defensivos agrícolas desnutrição alto nível de consanguinidade estresse ambiental manejo apícola inadequado

5 CCD pode estar afetando as abelhas nativas sem ferrão?
Será que as causas são as mesmas que afetam as A. mellifera? Um dos fatores seria a ação de pesticidas como inseticidas e herbicidas

6 Por que estudar os efeitos de agrotóxicos em jataí?
Ocorrência alta Facilidade de criação Facilidade de manutenção Espécies de Tetragonisca e sua distribuição Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) – Ocorre do México, América Central e América do Sul Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938) – Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo), Argentina, Bolívia e Paraguai Tetragonisca weyrauchi (Schwarz, 1943) – Bolívia, Perú e Brasil (Acre, Mato Grosso, Rondônia) Tetragonisca buchwaldi (Friese, 1925) – Costa Rica, Panamá e Equador

7 Tetragonisca weyrauchi – jataí acreana
Tetragonisca angustula Tetragonisca fiebrigi

8 Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população) Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas: Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2μg/abelha • Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22μg e 10,99μg/abelha • Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11μg e 100μg/abelha • Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100μg/abelha (Larini, 1999; Hunt, 2000)

9 Abelhas jataí Tetragonisca angustula e Tetragonisca fiebrigi como bioindicadores
Trabalho desenvolvido por Ana Lucia Paz Barateiro Stuchi – tese de doutorado – Pós-Graduação em Zootecnia (2005 a 2009) Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão gênica de abelhas do gênero Tetragonisca após contaminação com agrotóxicos para, posteriormente, utilizar esses insetos como bioindicadores de agrotóxicos.

10 A B EST-2 EST-3 EST-4 EST-1 + Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca fiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca angustula. (Sociobiology, v. 59, n. 1, ,2012)

11 Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca fiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento) Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiança Fipronil – contato 0,00062 0,00053 – 0,00075 Fipronil – ingestão 0,00123 0,00121 – 0,00127 Malathion – contato 0,50 ----- Malathion – ingestão 0,38 0,22 – 0,55 Neem - contato Neem - ingestão Thiamethoxam - contato 0,79 0,61 – 1,04 Thiamethoxam – ingestão 0,21 0,17 – 0,27

12 Inibição da atividade das esterases detectada em T
Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda Concentrações Esterases EST-1 EST-2 EST-4 Fipronil (%) 0,0001 - 0,0005 0,0006 0,0007 0,0011 Malathion (%) 0,0017 0,0018 0,0019 0,002 0,004 Thiamethoxam (%) 0,7 0,8 0,85 0,9 ++ 1

13 Inibição da atividade das esterases detectada em T
Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-1 EST-2 EST-4 Fipronil (%) 0,0011 - 0,0012 + 0,00125 0,0025 0,025 Malathion (%) 0,2 0,3 0,4 0,45 0,5 Thiamethoxam (%) 0,15 0,22 0,24

14 Malathion Controle EST-4 + EST-3 Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de T. angustula, mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.

15 Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T
Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T. angustula submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento) Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiança Fipronil – contato 0,00053 0,00024 – 0,00064 Fipronil – ingestão 0,00056 0,00053 – 0,00059 Malathion – contato 0,00315 ----- Malathion – ingestão 1,33 0,54467 – 2,18486 Neem – contato Neem – ingestão Thiamethoxam - contato 0,1622 0,06343 – 0,34581 Thiamethoxam – ingestão 0,2133 -0,00039 – 0,5357

16 Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-3 EST-4 Malathion (%) 0,0025 - + 0,0028 0,003 0,004 0,1 Thiamethoxam (%) 0,05 0,07 0,2 0,3

17 Inibição da atividade das esterases detectada em T
Inibição da atividade das esterases detectada em T. angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial Concentrações Esterases EST-3 EST-4 Malathion (%) 0,4 - 0,6 1 + 2 3 Thiamethoxam (%) 0,005 0,008 0,01 0,02 0,03

18 Abelhas jataí bioindicadores da presença de resíduos de Herbicidas
Trabalho desenvolvido por Fábio Fermino – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento (2008 a 2010) Herbicida Diluição (%) Concentração (g/ml) Sanson 40 SC Nicossulfuron 40 g/l 100 0,0003 75 0,000225 50 0,00015 10 0,00003 1 0,000003 Gramoxone 200 1,1'−dimetil−4,4'−bipiridilio dicloreto (paraquat) 200g/l 0,0015 0,000015 0,1 0,

19 Sanson 40 SC® (nicosulfuron)
Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron (Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição. Teste Concentração (%) Concentração (g/ml) Mortas Vivas % Indivíduos mortos Controle (água destilada) ---- 56 Sanson 40 SC® (nicosulfuron) 1 0,000003 60 10 0,00003 4 57 6,5 50 0,00015 75 0,000225 46 8,0 100 0,0003 Total 8 339 Gramoxone 200® (paraquat) 0.1 0, 40 0,000015 0,0015 36 10,0 216

20 Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH),
superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão. Isoenzimas Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-3 EST-4 Nicosulfuron (%) 1% + 10% 50% 75% +- 100% Paraquat (%) 0,1% ++ -

21 Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH),
superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. fiebrigi após contato com Sanson e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão. Isoenzimas Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-1 EST-2 EST-4 Nicosulfuron (%) 1% + 10% 50% 75% +- 100% Paraquat (%) 0,1% - ++

22 ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ESTERASES E PROTEÍNAS TOTAIS DE tetragonisca angustula Latr.VISITANTES DE FLORES DE CAFÉ (Coffea arabica L.) APÓS PULVERIZAÇÃO COM O INSETICIDA neem Trabalho desenvolvido por Mayra Cristina de Araujo – Monografia – especialização em Biotecnologia aplicada a agroindústria - UEM Vista da entrada do ninho de T. angustula utilizado no bioensaio durante a florada de cafezal em Apucarana-PR Vista da florada de cafezal (C. arábica) em Apucarana-PR

23 Local: Cafezal do Sítio Penitente em Apucarana – Paraná
Início da florada (botões florais começando a abrir) cafeeiros foram pulverizados com o inseticida neem comercial Caixa comerciais de jataí foram instaladas como segue a aproximadamente 100m do pés de café: Tratamento: uma das caixas foi instalada a 100m de uma fileira lateral e 24 horas depois foi realizada a aplicação do inseticida comercial neem de acordo com as instruções constantes da embalagem; Controle: A segunda caixa de jataí foi instalada na extremidade oposta a aproximadamente 600m de distância da caixa anterior e 24 horas depois foi realizada pulverização apenas com água.

24 No campo foi observado que:
Operárias adultas foram coletadas na entrada do ninho tratado e controle após: 24h 48h 72h Análise das esterases: inibição parcial das EST-3 e EST-4 após 48h da contaminação, em comparação com o controle. Análise das proteínas totais: ocorreu um aumento na quantidade de peptídeos após 24h da contaminação No campo foi observado que: os pés de café pulverizados com neem repeliram parte das T. angustula que estavam forrageando e que não houve mortandade de abelhas após a aplicação do inseticida.

25 Análise da expressão gênica em Tetragonisca angustula L
Análise da expressão gênica em Tetragonisca angustula L. após a contaminação com inseticidas Trabalho desenvolvido por Carlos Vinício Prescinato De Oliveira – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento

26 Inseticidas reguladores de crescimento
Galaxy EC 100 – princípio ativo Novaluron Natuneem – extrato da planta neem (Azadirachta indica )– princípio ativo azadiractina AzaMax – princípio ativo azadiractina Contaminação por contato dentro das colmeias por longo período de tempo Concentrações subletais Bioensaios realizados no setembro de 2010 a outubro de 2011

27 Gallaxy EC 100 princípio ativo - novaluron (100g/L), é um inseticida regulador de crescimento que atua principalmente na síntese da cutícula do inseto, inibindo a síntese de quitina e, consequentemente, inibindo a muda do inseto. Azadiractina - pode afetar a sobrevivência, causar repelência, deterrente alimentar (impede que outros organismos se alimente da planta), regular o crescimento, reduzir a fertilidade de fêmeas, causar anormalidades anatômicas, provocar efeitos histopatológicos prejudiciais em glândulas produtoras de neurôrmonios, em tecidos reprodutivos e em células epiteliais do intestino, afetar o metabolismo de proteínas em insetos.

28 Diluições dos inseticidas utilizados nos experimentos
Concentrações em % Gallaxy EC 100 0,5 6,25 10 NatuNeem 2,5 100 AzaMax 1 5

29 Procedimento experimental
Inseticidas diluídos em água destilada Aplicou-se 01 mL do inseticida diluído em folha de papel filtro (12,5 ± 0,1 cm) – colocadas para secar. Folhas de Papéis filtros contaminadas foram introduzidas no interior dos colmeias Controle – mesmo procedimento para os ninhos contaminados, porém aplicou-se apenas 01 mL de água destilada

30 Coletas de operárias para análise das esterases e proteínas totais:
48 horas 120 horas 168 horas 30 dias 60 dias

31 Esterases Galaxy ED 100 NatuNeem AzaMax EST-4 + 60 dias 0,5% + 48 horas 2,5% - 30 dias 0,5% - 48 horas 1% + 60 dias 1% EST-3 Sem alteração Sem alteração

32 Inseticidas utilizados
Concentrações em % Gallaxy EC 100 6,25 Síntese de novos peptídeos até 168 horas NatuNeem 0,5 Redução da síntese proteica e surgimento de peptídeos após 60 dias 2,5  Surgimento de peptídeo após 48 horas  alterações até 168 horas 100  Novo peptídeo (120 horas) e alterações na síntese até 168 horas AzaMax 1  Aumento da síntese proteica até 168 horas

33 Eletroforese SDS-PAGE 7% de T
Eletroforese SDS-PAGE 7% de T. angustula após a exposição ao inseticida Gallaxy EC 100 6,25% por 120 horas, coloração nitrato de prata. Os asteriscos seguidos de letras são para identificar horizontalmente as regiões de peptídeos afetados. P.M: padrão de peso molecular : controle : tratados.

34 Após 48 horas da contaminação com AzaMax a 5% não foi possível coletar abelhas na entrada do ninho - nos períodos de forrageamento, manhã e tarde, a partir de 48 horas após contaminação a quantidade de abelhas na entrada do ninho e forrageando diminuiu drasticamente ao longo dos dias. Nenhuma abelha morta foi encontrada no entorno do ninho. seria a ação repelente do AzaMax?

35 Pesticidas em concentrações subletais alteram a expressão de esterases e de proteínas solúveis em abelhas T. angustula e T. fiebrigi Essas alterações refletem o metabolismo intermediário dessas abelhas – detoxificação O aumento de síntese de proteínas pode estar levando essas abelhas a apresentarem uma resposta ao estresse ambiental (presença do pesticida) que pode ser: Nova proteína sintetizada Comportamental, por exemplo: alteração na orientação, abandono do ninho

36 Questões a serem respondidas
A rainha é afetada pelos pesticidas? E a cria? Há contaminação do mel e pólen? Com quais pesticidas ocorre alteração comportamental ? Quais alterações? Quais as concentrações míneemas que afetam as abelhas e seus produtos?

37 Qualidade do Mel É importante destacar que a composição exata de qualquer mel depende, principalmente, das fontes vegetais das quais ele é derivado, mas também do clima, solo e outros fatores Várias metodologias utilizadas para a determinação de resíduos de agrotóxicos são baseadas em métodos cromatográficos Resíduos de contaminantes também podem ser identificados em amostras de pólen - cromatografia líquida com espectrometria de massa A presença de resíduos de pesticidas pode ser identificada ainda com o corpo das abelhas – mas não há técnica eficiente. Uma técnica utilizada é a cromatografia gasosa

38 Alguns cuidados que podem diminuir a contaminação com agrotóxicos
Se houver cultivo nas proximidades verificar se há uma grande faixa de vegetação nativa – início da faixa – 1,5 Km da lavoura Os limites estabelecidos de acordo com o RT (tempo residual) de cada substância devem ser respeitados, e evitar a aplicação de inseticidas que tenham RT acima de 8h.

39 Não se deve fazer pulverizações quando a temperatura estiver muito baixa – porque isso aumenta o RT
Não se aplicar pesticidas durante o pleno florescimento da cultura ou de plantas presente nas proximidades Usar as formulações menos perigosas quando for possível – formulações granuladas e em solução. Evitar o uso de microcápsulas – liberam o ingrediente ativo gradativamente As instruções estabelecidas pelos fabricantes devem ser obedecidas, respeitando a quantidade e a forma de aplicação.

40 Obrigada!