FISH Hibridização in situ por Fluorescência

Apresentação em tema: "FISH Hibridização in situ por Fluorescência"— Transcrição da apresentação:

1 FISH Hibridização in situ por Fluorescência
Cristina Grumann

2 FISH O que é? É a técnica de citogenética molecular mais comumente utilizada. Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar anomalias cromossômicas que estão além do poder de resolução da citogenética de rotina, como microdeleções e rearranjos cromossômicos complexos.

3 FISH O que faz? Detecta seqüências específicas de ácidos nucléicos pela formação de um duplex de um fragmento de ácido nucléico de fita simples modificado (sonda) e sua seqüência complementar (seqüência alvo) no espécime fixado. A sonda de DNA reconhece e se hibridiza com sua seqüência complementar no cromossomo.

4 FISH - Vantagens Pode ser aplicada tanto para células em pró-metáfase, metáfase como em interfase, o que permite fazer diagnósticos citogenéticos mais acurados, tanto para anormalidades constitucionais, quanto para mudanças cromossômicas adquiridas como no caso de células cancerosas. É também um instrumento valioso para mapeamento gênico.

5 FISH - Vantagens Pesquisas de aneuploidias podem ser feitas mais rapidamente. Não há necessidade de crescimento em culturas das células. Tecidos preservados podem ser investigados. Pode ser aplicado para lâminas padrões de citogenética, mas também para tecidos fixados em formol, amostras de sangue e de medula óssea.

6 FISH - Vantagens Quanto às bandas:
Identificação de alterações além da resolução visual (microdeleções). Visualização de rearranjos cromossômicos em regiões camufladas pelas bandas (rearranjo crítico). Rearranjos de difícil interpretação como rearranjos dentro do cromossomo.

7 FISH - Etapas Preparação das sondas:
- Método direto: ligação com fluorocromo; - Método indireto: moléculas sinalizadoras - biotina, digoxigenina - conjugam-se com outra molécula ligada ao fluorocromo (avidina ou anticorpos).

8 FISH - Etapas Preparação dos cromossomos. Preparação das lâminas.
Desnaturação da sonda e do DNA cormossômico aquecimento em solução de formamida (70C).

9 FISH - Etapas As sondas então colocadas sobre as lâminas que são incubadas a 37C “overnight” em câmara úmida e escura. Durante esse período, a sonda se liga à região alvo do cromossomo e ocorre a hibridização.

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12 FISH - Etapas No dia seguinte, a lâmina é lavada para a remoção das sondas em excesso. Contracoloração (counterstainig) Adição de soluções que irão colorir o resto do material cromossômico. Mais usadas: DAPI (azul), propidium iodice (vermelho)

13 FISH - Etapas Visualização: em microscópio epifluorescente.
filtros específicos para o os fluorocromos e “couterstaining”.

14 FISH - Tipos de Sondas Sondas centroméricas ou alfa satélites para seqüências de DNA repetitivo localizadas no centrômero ou região pericentromérica. Adequada para diagnóstico de aneuploidias.

15 Sonda Centromérica

16 Sonda Centromérica

17 Sonda Centromérica Em vermelho, cromossomo X e em verde, o Y

18 Sonda Centromérica

19 FISH - Tipos de Sondas Sondas de seqüência única para o cromosssomo sondas específicas para deteminado loco ou gene. Deleções e duplicações submicroscópicas.

20 Sondas de Seqüência Única

21 FISH - Tipos de Sondas Sondas para cromossomo inteiro “pintura cromossômica” Rearranjos complexos; Identificação da origem de material cromossômico adicional (cromossomos em anel).

22 Sonda “Painting”

23 Sonda “Painting” Em vermelho, o cromosomo 4

24 FISH - Tipos de Sondas Cariotipagem por espectro multicolorido
Detecção de pequenos rearranjos cromossômicos constitucionais ou adquiridos, como no câncer.

25 Espectro Multicolorido

26 FISH - Aplicações Detecção de aneuploidias
Aneuploidias dos cromossomos X e Y e trissomias do 21, 13 e 18 são responsáveis por 90% das anomalias cromossômicas. Diagnóstico em poucas horas. Análise linfócitos do sangue periférico e amostras de vilosidades coriônicas, células do líquido amniótico ou cordão umbilical (em diagnóstico pré-natal). Utilização de sondas de seqüência única ou alfa satélite. Contagem dos sinais fluorescentes na célula interfásica.

27 FISH - Aplicações Diagnóstico pré-implantação
Possível com os avanços no campo da fertilização “in vitro”. Remoção de 1 ou 2 blastômeros em embriões de 3 dias. Permite diagnóstico de alterações cromossômicas ou gênicas. Seleção de sexo do embrião (em doenças ligadas ao X).

28 FISH - Aplicações Diagnóstico pré-implantação
Obs: Limitação da alta freqüência de mosaicismo na fase inicial do desenvolvimento humano com aneuploidias e poliploidias.

29 Trissomia do 21

30 FISH - Aplicações Síndromes de Microdeleções
Deleções pequenas e de difícil detecção. Diagnóstico mais preciso. Análise dos cromossomos em metáfase ou interfase. Usadas duas sondas: uma cromossomo-específica e outra loco-específica.

31 FISH - Aplicações Exemplos:
Síndrome de Williams (7q-) - deleção de gene da elastina. Síndrome de Prader- Willi/Angelman(15q-). Síndrome do Miado do gato - cri-du-chat (5p-). Deficiência de esteróide-sulfatase (Xp-).

32 Síndrome de Williams Em verde o cromossomo 7 e, em vermelho, o gene da elastina

33 Deficiência de Esteróide-sulfatase
Deficiência de esteróide-sulfatase- Microeleção no cromossomo X

34 FISH - Aplicações Leucemias Avaliação da origem clonal.
Caracterização das alterações cromossômicas e estruturais diagnóstico, prognóstico e tratamento. Detecção de doença residual mínima. Identificar recaída da doença. Monitoramento pós-transplante: quando doador e receptor são de sexos diferente para verificação da proporção de células XX e XY.

35 FISH - Aplicações Leucemia Mielóide Crônica (LMC)
- Avaliação da presença do crossomomo Philadelphia - translocação entre 9 e 22- não visualizada em 5% das análises da citogenética padrão. Caracterização, prognóstico, diagnóstico e tratamento. Monitoramento da eficácia do tratamento

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37 FISH - Aplicações Leucemia Linfóide Crônica
Trissomia do 12 em 30% dos casos. 14 q+ em 20%. Alterações do 13 em 20%. Deleção 6q em 10%.

38 FISH - Aplicações Leucemia Mielóide Aguda
Leucemia promielocítica aguda: rearranjo PML/RAR- t(15;17). Leucemia mielomonocítica aguda: pesquisa da inversão do cromossomo 16 Leucemia monocítica aguda: pesquisa de alterações envolvendo o gene MLL. Leucemias com monossomia 7, 5 ou trissomia 8 para detecção de doença residual no controle pós terapia. Leucemia mielóide aguda com Ph ou BCR/ABL.

39 FISH - Aplicações Leucemia Linfóide Aguda Cromossomo Ph.
Rearranjo do gene MLL. Hiperdiploidia. Rearranjo dos genes TEL/AML1

40 FISH - Aplicações Câncer de Mama
FISH é utilizado para demonstrar a amplificação de genes. A superexpressão de oncogenes tem papel importante na progressão de vários tumores. 25-30% dos tumores de mama e ovário tem amplificação do gene HER2/neu.

41 FISH - Aplicações HER2/neu é um proto-oncogene localizado no cromossoma 17 e que codifica uma oncoproteína transmembrana, a p185HER2. A presença do HER2/neu determina rápida proliferação do tumor e muita agressividade. Através de sondas de DNA complementares marcadas com fluorocromo, pode-se visualizar um número aumentado de cópias do gene em relação às 2 normalmente existentes.

42 Cromossomo 17 em verde e os genes Her2 em laranja.

43 Bibliografia ROONEY D.E., CzZEPULKOWSKI B.H.. Human Cytogenetics - Essencial Data. Reino Unidio. Ed. Wiley, 1997. leukemia/guide/1660s13.jpg &lng=en&nrm=iso&tlng=pt php