BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas

Apresentação em tema: "BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas"— Transcrição da apresentação:

1 BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas
Docentes Célia R Carlini Charley C. Staats Diogo R Demartini Hugo Verli Súmula Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X; Dicroísmo circular Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise. Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância; fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico. Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos: precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação; química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.

2 BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas
22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley 23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo 24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia 25/11 Espectrometria de massas e proteômica 29/11 – 02/12 Seminários 1 tópico por dia 5 grupos por tópico

3 Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos
Papéis Biológicos de D-Aminoácidos Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação) Assinalamento de padrões (bioinformática) Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises Síntese de peptídeos para avaliação biológica Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas) Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade) Metodologias de quantificação de proteínas Precipitação fracionada Métodos Imunoquímicos Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica MudPit / GELC – MS Proteômica quantitativa comparativa Metaloproteômica Fosfoproteômica Interatoma Tópico 4 – Determinação de estrutura RMN Dicroísmo circular Fluorometria Cristalografia – Raios X Determinação de motivos estruturais

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Avaliação Apresentação de 1 item referente a cada tópico Respostas aos questionários aplicados pelos colegas Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada tópico para responder As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Espera-se que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela presente no artigo científico. O autor da questão será responsável pela correção. Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço

5 Sorteio

6 Amino-Ácidos

7 Estrutura geral dos Aminoácidos

8 Quantos aminoácidos existem em sistemas biológicos?

9 20 aminoácidos definidos por seu códon no mRNA Grupo R 5 grupos distintos 2 aminoácidos não usuais Inserção depende de um elemento cis no mRNA

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15 Polar - aquoso Apolar - lipídico Polar - aquoso

16 Selenocystein Pyrrolysine

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18 Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. tRNAPyl (anticodon CUA) is either first aminoacylated with lysine, and subsequently modified to generate Pyl-tRNAPyl, or alternatively Pyl-tRNAPyl is directly synthesized by an unknown route. Pyl-tRNAPyl would then bind the SelB-like elongation factor EF-Pyl (see text for details of candidate EF-Pyl proteins). The Pyl-tRNAPyl:EF-Pyl complex would associate with the pyrrolysine insertion sequence (PYLIS) via a putative PYLIS binding protein (PBP), thereby directing delivery of Pyl-tRNAPyl to the ribosomal A site when the decoding site is occupied by the corresponding UAG. Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18: ©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

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20 Formação de pontes de enxofre

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22 Estereoisomeros a-carbon is a chiral center
Two stereoisomers are called enantiomers. The solid wedge-shaped bonds project out of the plane of paper, the dashed bonds behind it. The horizontal bonds project out of the plane of paper, the vertical bonds behind.

23 The Stereochemistry of Amino Acids

24 D-aminoácidos existem e são metabolizados

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28 Serine-racemase

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31 D-amino ácidos em proteínas?

32 Características físico-químicas dos aminoácidos

33 Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos

34 Estudos conformacionais – Try fluorescence
Changes in low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. Changes in intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. The fluorescence emission of tryptophan residues in LDL-R354 was measured from 300 to 400 nm at 1-nm increments after excitation at 280 nm. Fluorescence intensity measurements are expressed in arbitrary units as the ratio of channel A (sample channel) to channel B (reference channel). Each sample contained 7.4 μg of protein in 10 mm Tris, 60 mm KCl, pH 7.4. (Squares, 100 μm free Ca2+; circles, 100 μm EDTA; closed symbols, 7.4 μg LDL-R354; open symbols, buffer alone [no protein]). Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39: ©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

35 Zwitterion = íon híbrido

36 Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.

37 Efeito sobre o pKa do ambiente químico

38 Henderson/Hasselbach equation and pKa
Protonated form Unprotonated form (conjugate base) HA ↔ H+ + A- Ka = [H+] [A-] / [HA] [H+] = Ka [HA]/ [A-] -log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-]) -log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-]) pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])

39 Titulação de um aminoácido

40 Curva de titulação Glutamato

41 Curva de titulação> Histidina
Anel indólico

42 Peptídeos

43 Formação da ligação peptídica

44 Níveis estruturais das proteínas

45 Como se definem estruturas secundárias?

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47 Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são menores que as de uma ligação amida comum
Ressonância eletrônica Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanar

48 Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa
Cadeias laterais

49 A B C D E F Gráfico de Ramachandran

50 O que é um domínio protéico?

51 Procura de domínios conservados

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58 Localização da proteína pode trazer informações sobre a sua função

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