Conceitos Prévios O que é DNA? Aonde se localiza o DNA numa célula ?

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1 Conceitos Prévios O que é DNA? Aonde se localiza o DNA numa célula ?
Do que são formadas as membranas celulares ? Qual a estrutura do DNA?

2 DNA G T C A DNA determina as características de todos os seres vivos.
DNA é composto de um alfabeto de 4-letras (nucleotídeo/ molécula) referido como A, T, C, and G. A ordem do alfabeto determina as características do organismos, como as letras de nosso alfabeto determinam as palavras. Cada célula do corpo humano contém >3 BILHÕES de letras. G T C A

3 A única diferença entre os organismos vivos é a quantidade e ordem do alfabeto de DNA.

4 Célula Cloroplasto Núcleo (DNA) Mitocôndria Vacúolo Citoplasma
Parede celular Membrana celular

5 Estrutura do DNA

6 Componentes do DNA DNA é um polímero, sendo os monômeros os nucleotídeos, chamado então de polinucleotídeo. Cada nucleotídeo consiste de um açúcar de 5 carbonos (desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao açúcar e um grupo fosfato. Quatro nucleotídeos, que diferem somente na base nitrogenada. A = adenina G = guanina C = citosina T = timina

7 Definições A combinação de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleosídeo. A combinação de um fosfato, de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleotídeo.

8 Adenina e Guanina são Purinas. As Purinas são as maiores bases.
9 átomos cada

9 Timina e Citosina são chamadas Pirimidinas.
6 átomos cada

10 A Hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro
nucleotídeo se liga ao grupo fosfato ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotídeo através de uma ligação fosfodiéster (ligação covalente)

11 Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nas
características de hidrofobicidade das moléculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma: O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) – estão localizados na parte externa da molécula.  As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) – estão localizadas na parte interna da molécula.

12 Primeiro rascunho do Francis Crick da estrutura do DNA

13 Pontos importantes Por convenção, um polinucleotídeo é lido da extremidade 5´para a 3´. As orientações das duas fitas é antipararela: suas direções 5' - 3' são opostas. As duas fitas são mantidas unidas pela energia de muitas pontes de hidrogênio (A=T e G=C) e interações hidrofóbicas.

14

15 Extração e Quantificação
Ácidos Nucleicos

16 DNA na minha comida???

17 Cada célula contém cerca de 3 metros de DNA.
DNA na minha comida??? CURIOSIDADE: Cada célula contém cerca de 3 metros de DNA. Refeição = células ou Cerca de km de DNA.

18 DNA na minha comida??? DNA está presente nas células de todos os organismos vivos. O processo de extração de DNA de uma célula é o primeiro passo em vários procedimentos de um laboratório. Deve-se separar o DNA de substâncias indesejáveis da célula, gentilmente, para que o DNA não se desnature (“quebre”). Introdução

19 DNA na minha comida ??? Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma solução de banana tratada com sal, água destilada, e shampoo (detergente) . O detergente quebra a membrana celular, dissolvendo os lipídeos (moléculas de gordura) e proteínas da célula, além de quebrar as ligações que mantêm a membrana celular intacta. Introdução

20 DNA in minha comida ??? O detergente forma então um complexo com os lípídeos e proteínas, permitindo que sejam filtrados para fora da solução com um filtro de café. O DNA das células ficam no filtrado. O sal permite que o DNA precipite com a adição de álcool (íons Mg e Cl). Introdução

21 DNA na minha comida??? Extração de DNA

22 DNA na minha comida??? Passo 1
Em um liquidificador, misturar uma banana com um copo de água destilada (250ml). Extração de DNA

23 DNA na minha comida??? Passo 1 (cont.)
Bater por for segundos, até a solução virar uma mistura. Extração de DNA

24 DNA na minha comida??? Passo 2
Num copinho de café, fazer uma solução contendo 1 colher de chá de shampoo ou detergente e 2 pitadas de sal de cozinha. Extração de DNA

25 DNA na minha comida??? Passo 2 (cont.)
Adicionar 20 ml (4 colheres de chá) de água destilada. Dissolver o sal e o shampoo/ detergente mexendo devagar para evitar fazer espuma. Extração de DNA

26 DNA na minha comida??? Passo 3
À solução do passo 2, adicionar 3 colheres cheias da solução de banana do passo 1. Misturar a solução com a colher por 5-10 minutos. Extração de DNA

27 DNA na minha comida??? Passo 4
Enquanto uma pessoa mistura a solução de banana, outra coloca um pedaço (cone) de filtro de café dentro do outro copo de plástico. Dobre as abas do filtro para fora para que não encoste no fundo do copo. Extração de DNA

28 DNA na minha comida??? Passo 5
Filtre a mistura no filtro e deixe a solução drenar por vários minutos até ter cerca de 5 ml (cobrindo o fundo do copo) do filtrado para testar. Extração de DNA

29 DNA na minha comida??? Passo 6
Pegar um tudo com álcool gelado. Para melhores resultados, o álcool deve estar o mais gelado possível. Extração de DNA

30 DNA na minha comida??? Passo 7
Encher a pipeta de plástico com a solução de banana. Extração de DNA

31 DNA na minha comida??? Passo 8
Adicionar a solução ao álcool. Deixe descansar por 2 a 3 minutos sem mexer o tubo. É muito importante não agitar o tubo. Extração de DNA

32 DNA na minha comida??? Resultados
Você pode assistir o precitado branco de DNA na camada de álcool. O DNA tem uma aparência de um muco esbranquiçado e como se fosse uma nuvem. Extração de DNA

33 Extração com Fenol Fenol é usado para desnaturar e remover proteínas de soluções que contêm ácidos nucléicos. Homogeneização do material (nitrogênio líquido ou banho de gelo seco e etanol), com tampão. 2. Adicionar o mesmo volume de fenol à amostra, colocar no vortex ou agitar. 3. Centrifugar para separar 2 fases (de fenol embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa para novo tubo. Repetir 2 e 3.

34 Extração com Fenol (Cont.)
4. Repetir a extração agora com 24:1 Clorofórmio: álcool isoamílico. Centrifugar, recolher fase aquosa e repetir 4. 5. Adicionar 0,1 volume de NaOAc 3M + 1,8 volumes de etanol 95% gelado, inverter tubo algumas vezes (passo para livrar o DNA dos sais e concentrar o DNA). 6. Se houver precipitação ou “nuvem”, centrifugar 5 a 10 min. Se não conseguir ver DNA, -20ºC 15’ a o/n e centrifugar. Retirar EtOH Lavar precipitado com 70% etanol e centrifugar 8. Retirar etanol, secar ao ar e ressuspender em TE ou ddH20 (50 a 500 µl)

35 Pontos Importantes O fenol é usado para remover proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA. O clorofórmio ajuda desnaturar proteínas e a remover o fenol residual. O álcool isoamílico é geralmente adicionado ao clorofórmio para reduzir espuma.

36 Extração Simples Material + Tampão de Lise: Tris, EDTA, SDS, NaCl e proteinase K. Digestão a 37 ºC (células, 2-3 hs) ou 55 ºC (tecido, overnight) sob agitação. Precipitação com isopropanol Resgatar o precipitado (nuvem) e ressupender em água ou TE.

37 Extração de DNA plasmidial
Plasmídeos: pedaços de DNA extracromossômicos, covalentemente fechados; Codificam genes de resistência à antibióticos ou metais pesados, produção de pigmentos, de virulência, etc. Também possuem genes para sua própria replicação 1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fácil a separação dos DNAs

38 Extração de DNA plasmidial
Depois de crescer o plasmídeo recombinante em bactéria, temos que nos livrar dos outros componentes das células bacterianas (membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal Centrifugar cultura e ressuspender pellet em tampão Tris EDTA (que liga divalentemente a cátions Ca e Mg e com isto ajuda a desestabilizar a membrana de E. coli). Então adicionamos uma solução com NaOH (que aumenta o pH e desnatura o DNA cromossomal e não o do plasmídeo) e SDS (que vai solubilizar as membranas e causar a lise das células).

39 Extração de DNA plasmidial (cont.)
Decrescemos o pH com acetato de potássio (o DNA cromossomal não poderá a voltar a sua estrutura original e sairá de solução) Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitará e o plasmidial ficará em solução junto com proteínas e sais. Purificar o DNA com extração com fenol e clorofórmio, seguido de precipitação com etanol ou com uma membrana de sílica gel (o DNA vai se ligar à membrana sob altas concentrações de sais e se “desligar” com a redução da concentração de sais, ao contrário das proteínas e sais que passarão direto. Após lavagem com etanol para lavar os sais o DNA pode ser eluído O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A

40 Extração de RNA Envolve desnaturante forte para quebrar células, solubilizar seus componentes e desnaturar RNAses endógenas simultaneamente. Envolve lise das células, desnaturação das proteínas da membrana celular e depois os passos normais como em DNA Solução Desnaturante: Tiocianato de Guanidina 4M Citrato de Sódio 25 mM 0.5% Sarcosil Beta-Mercaptoetanol 0.1 M

41 Extração de RNAm 1,5 a 5% do RNA celular
Usada para RNAm raros, para fazer sondas ou para bibliotecas de cDNA. Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia sintética de timinas) Já possível para procariotos

42 O RNA está INTACTO??? Gel de agarose desnaturante: para
desfazer a estrutura secundária do RNA

43 Quantificação Para quê: Sintetizar cDNA para produção de biblioteca
Purificação de fragmentos de DNA para subclonagem Quantificação de produtos amplificados Detecção de moléculas de DNA em preparações de drogas.

44 Quantificação Quantificação Mais usada com Espectrofotômetro
A260 dá estimativa da concentração Leitura da absorbância a 260 e 280 nm OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL; RNA = 40 µg/mL Desvantagens: interferência com material para extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: ng DNA/ mL RNA e pH (>7,5): pH ácido afeta a absorção com A260, ajustar com Na2HPO4 (conc. final de1mM)

45 Como fazer Reagentes e Equipamento
Espectrofotômetro UV, cubetas de quartzo, ddH20 1 Zerar o aparelho com ddH20 2 Diluir um volume conhecido de ácido nucleico em água. 3 Realizar a leitura em OD260 e OD280. 4 Calcular a concentração.

46 Cálculos OD260 x F. D. x 50 (µg/mL) DNA [ ] (µg/µL) = 1000
F.D. = fator de diluição Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,0157 DNA [ ]= 0,0157 x 33,33 x 50 / 1000 = 26,16 ng/ µl

47 Pureza DNA: Razão A260/A280 >= 1,75 - 1,80
< 1,75 contaminação com lipídeos ou proteínas RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0 < 2,0 contaminação com guanidina (da extração) > 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio

48 OUTROS MÉTODOS Fluorímetro: utiliza material fluorescente que se liga ao ácido nucléico sem problemas com proteínas (picoGreen; sondas de cianina). Seletivos para dsDNA. Vantagem maior é a sensibilidade: 0,5 ng/ mL (100 a 1000 vezes maior que o espectrofotômetro)

49 OUTROS MÉTODOS Gel de agarose: aplicando-se as amostras de DNA juntamente com padrões de concentração conhecida 100 a 300 ng de plasmídeo

50 Por meio de corrida junto a um marcador de DNA

51 Ácidos Nucléicos Estabilidade DNA versus RNA Nucleases
Cuidados: autoclavagem de materiais e tampões; estocagem (DNA e RNA). TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x nucleases e DEPC x RNAses

52 Armazenagem de DNA e RNA
DNA: 4°C (em TE) ou - 20°C (maior tempo) RNA: manter sempre no gelo quando manipulado e a - 70°C (maior tempo)

53 Pontos Importantes Maioria das nucleases precisam de Mg para atividade, o EDTA ajuda na inativação delas. RNA é normalmente armazenado em ddH20 que foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar as RNAses. Muitas RNAses sobrevivem à autoclavagem então DEPC deve ser usado também para soluções. Importante inativar DEPC antes de usar pois pode modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases) DEPC é altamente tóxico para humanos !!! DEPC é incompatível com TRIS !!!

54 ANIMAÇÃO

55 ANIMAÇÃO