DNA Microarrays.

Apresentação em tema: "DNA Microarrays."— Transcrição da apresentação:

1 DNA Microarrays

2 O que é DNA Microarray? Também conhecido como chip de DNA
Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma (expressão dos genes) Transcrição? Processo de cópia do DNA em RNA mensageiro Dependente do meio Microarray detecta mRNA

3 O que é DNA Microarray? Cheung et al. 1999

4 Como fazer um microarray?
Começa-se com genes individuais (p. ex. ~6,200 genes do genoma de fungos) Amplifica-se todos eles por PCR “Spot” todos em um meio, como por exemplo lâmina de vidro de microscopia. Cada spot tem 100 µm de diâmetro Spotting feito por um robô. Etapa complexa e crítica do processo.

5 Como fazer um microarray?
Cheung et al. 1999

6 Exemplo Fungo Cresce em ambientes aeróbicos e anaeróbicos
Diferentes genes serão ativados no intuito de se adaptar a cada ambiente. Extrai-se o mRNA Converter o mRNA em cDNA marcado com fluorescência

7 Exemplo Misturar o cDNA Hibridizar com a sonda
Cada sequência hibridiza com o gene correspondente no array Lavar o cDNA não hibridizado Ler com laser Analisar a imagem

8 Brown & Botstein, 1999

9 Lendo um array O laser escaneia o array e produz imagens
Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho) Análise da imagem: Supressão de background Localização e detecção dos spots, incluindo a redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.

10 Lendo um array (cont.) Block Column Row Gene Name Red Green
Red:Green Ratio 1 tub1 2,345 2,467 0.95 2 tub2 3,589 2,158 1.66 3 sec1 4,109 1,469 2.80 4 sec2 1,500 0.42 5 sec3 1,246 1,258 0.99 6 act1 1,937 2,104 0.92 7 act2 2,561 1,562 1.64 8 fus1 2,962 3,012 0.98 9 idp2 3,585 1,209 2.97 10 idp1 2,796 1,005 2.78 11 idh1 2,170 4,245 0.51 12 idh2 1,896 2,996 0.63 13 erd1 1,023 3,354 0.31 14 erd2 1,698 2,896 0.59

11 Real DNA Microarray

12 Y-fold Fold – quantas vezes Expressão como repressão ou indução Y-fold
Calculado como o inverso da razão Razão de 0.33 = repressão 3-fold Razão de 10 = indução de 10-fold

13 Codificação de cor Dados apresentados em escala de cor Esquema: Ou
Verde: reprimido (menos mRNA) Vermelho = induzido (mais mRNA) Preto = sem mudança (1:1 ratio) Ou Verde - controle (e.g. aeróbico) Vermelho = experimento (e.g. anaeróbico) Somente usada razão

14 Complicação: Série em Tempo
Medida a cada 2 horas por 10 horas (depleção de oxigênio) 31,000 razões da expressão de genes 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos cada Alguns genes respondem de maneira igual a depleção de oxigênio?

15 Exemplo: mudança de ratios (razão)
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene C 1 8 12 16 Gene D 3 4 2 Gene E Gene F 0.25 0.1 Gene G Gene H 0.5 0.33 Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N 0.125 0.0833 0.0625 Qual o padrão? Campbell & Heyer, 2003

16 Exemplo: transformação em log
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene C 3 3.58 4 Gene D 1.58 2 1 Gene E Gene F -2 -3.32 Gene G Gene H -1 -1.60 Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N -3 -3.59 -4 Campbell & Heyer, 2003

17 Examplo: Coeficiente de Pearson
Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N 1 0.94 0.96 -0.40 0.95 -0.95 0.41 0.36 0.23 -0.94 -1 0.84 -0.10 0.68 0.24 -0.07 -0.57 0.89 -0.89 0.21 0.30 0.43 -0.84 -0.96 -0.35 0.35 0.60 -0.43 -0.79 0.10 0.40 0.48 0.22 0.11 -0.48 -0.21 -0.11 -0.75 -0.68 -0.41 -0.24 -0.36 0.07 -0.23 Campbell & Heyer, 2003

18 Exemplo: reorganização de dados
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours Gene M 1 0.33 0.25 0.5 Gene N 0.125 0.0833 0.0625 Gene H Gene K 3 Gene J 2 Gene E 4 8 Gene C 12 16 Gene L Gene G Gene D Gene I Gene F 0.1 Campbell & Heyer, 2003

19 Exemplo: Campbell & Heyer, 2003

20 Genoma inteiro do fungo
Campbell & Heyer, 2003

21 Tecnologia do DNA Microarray

22 DNA Microarrays

23 O que é Microarray? Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada.

24 PAra que é utilizado? Análise de expressão Genotipagem de SNP
Profile de cromatina Identificação de inserções Análise de metilação de DNA

25 Por que usar Microaaray para análise de expressão?
Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um gene em um experimento Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais

26 Análise de Expressão Convencional
RNA Control Cells Treated Cells RNA Electrophoresis and Blotting Hybridization Labeled probe – gene “X”

27 Análise de expressão usando Microarray
RNA Control Cells Treated Cells RNA Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

28 Tipos de Microarrays Spotted Arrays Affymetrix cDNA ou DNA genômico
Oligonucleotídeos Affymetrix

29 Spotted Arrays Affymetrix Arrays Homemade Desenhado Mais barato? Máximo de análises por experimento Susceptível a variabilidade Disponível comercialmente Definido anteriormente Mais caro????? Maximo de análises por experimento Menos variável

30 Produção de Spotted Arrays
Sondas de DNA preparadas em placas de 384 Lâminas de vidro compradas comercialmente ou homemade mesmo Arrays são spoted com um robô comercial Replicatas Controles

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32 Spotted Array Printing
Sonicator Water bath Sonicate Pick up Wash Print 384-well plate 1” x 3” glass slide

33 Spotted Array Printing
Sonicator Water bath Sonicate Pick up Wash Print 384-well plate 1” x 3” glass slide

34 Preparação da amostra alvo, marcação, hibridização, scaning e aquisição de dados
Isolamento de RNA Total RNA mRNA Transcrição reversa Marcação Hibridização e lavagem Scaning

35 RNA cDNA Isolate RNA Reverse transcription Label with Cy3
Treated Cells Control Isolate RNA RNA Reverse transcription cDNA Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize Microarray containing 16 probes Wash and Scan

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38 Bibliografia Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, (2000). Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics Supplement 21, (1999). Pritchard, C.C., Project normal: Defining normal variance in mouse gene expression. PNAS 98, (2001).