A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL para as CIÊNCIAS da SAÚDE

Apresentação em tema: "A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL para as CIÊNCIAS da SAÚDE"— Transcrição da apresentação:

1 A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL para as CIÊNCIAS da SAÚDE

2 Capítulo III. A Cinética Enzimática
Enzimas ?

3 Enzimas ? ? Catalisadores biológicos Poder catalítico e especificidade
Reguladas Nem todas as enzimas são proteínas Ribozimas... ?

4 As enzimas podem aumentar a velocidade das reacções pelo menos 1 milhão de vezes... COMO ?

5 PROTEÍNAS - Enzimas: cofactores
Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de cofactores - Metais

6 …Metais Enzimas: cofactores
Anidrase carbónica humana: requer zinco, que está ligado aos anéis imidazol de 3 resíduos de histidina e a uma molécula de água

7 Enzimas: cofactores Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de Pequenas moléculas orgânicas - COENZIMAS

8 Enzimas: cofactores … Pequenas moléculas orgânicas (coenzimas) Fosforilase do glicogénio: envolvida na utilização de glicogénio para produzir energia, requer a coenzima piridoxal fosfato (PLP)

9 Enzimas: cofactores COFACTORES Iões Metálicos Coenzimas
Iões Activadores Iões do local activo Cosubstratos Grupos prostéticos

10 Enzimas: classificação

11 Catálise Enzimática ... As interacções com o substrato, envolvem:
Enzimas: funcionamento Catálise Enzimática Depende de interacções precisas com o substrato... ... As interacções com o substrato, envolvem: forças de van der Waals forças electrostáticas pontes de hidrogénio interacções hidrofóbicas

12 Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)
Enzimas: especificidade Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)

13 Enzimas: funcionamento
As enzimas não conseguem alterar as leis da termodinâmica → não alteram o equilíbrio de uma reacção química A + B AB Uma enzima acelera os dois sentidos da reacção exactamente na mesma proporção

14 E + P ES E + S Enzimas: funcionamento
Formação de um complexo que representa o estado de transição... E + P      ES E + S

15 Enzimas: funcionamento

16 Enzimas: funcionamento
Facilitam a ocorrência do estado de transição, diminuindo a energia de activação, e consequentemente, aumentando a velocidade da reacção

17 O estado de transição existe?
Enzimas: funcionamento O estado de transição existe? Para uma concentração constante de enzima, a velocidade da reacção aumenta com o aumento da concentração do substrato, até se atingir uma velocidade máxima... ... todos os centros catalíticos estão preenchidos e, consequentemente, a velocidade da reacção …

18 O estado de transição existe?
Enzimas: funcionamento O estado de transição existe? Alterações nas características espectroscópicas de enzimas quando se adiciona substrato - complexo enzima substrato. A intensidade da fluorescência da sintetase do triptofano varia com a adição de serina e de indol (substratos)

19 Resolução de estruturas por cristalografia de raios-X
Enzimas: local activo Local Activo Resolução de estruturas por cristalografia de raios-X

20 Enzimas: local activo Lisosima

21 O local activo da Cardosina A
A resolução da estrutura 3D trouxe importante informação sobre o local activo permitindo esclarecer a especificidade desta enzima. - São conhecidas nas PAs as suas restrições em termos de especificidade secundária. Os resíduos adjacentes aos resíduos da ligação a ser cortada também desempenham papel importante, na hidrólise da ligação peptídica a ser clivada. Só aceita nos diferentes sub-locais determinados resíduos de aas. - Ou seja o estudo de especificidade da cardosina A como PAs que é, só fica completo quando se conhece a sua especificidade secundária. - Esquema explicar esq. - Péptido da k-caseina, com a ligação clivada pela cardosina A, Phe105 - Met106, que dá inicio ao processo de coagulação do leite. - Resíduos que estão a 4.0 Å do fragmento de K-caseína. - Vemos pelo nº de resíduos que estão envolvidos que o local activo é feito por uma rede intrincada de interacções, que contribuirão com certeza para a integridade da actividade da enzima que ocorre numa ampla gama de pH que vai de Contribuirão para a estabilidade do estado de transição e permitirão as interacções efectivas durante as alterações conformações necessárias à catálise.  8-10 aminoácidos no local activo  Preferência por resíduos hidrofóbicos Nomenclatura dos aminoácidos no local activo P3-P2-P1 – P`1-P`2-P´3

22 Asp catalíticos Protease aspártica

23 ESTRUTURA da Cardosina A
A estrutura primária obtida por sequênciação da proteína isolada, revelou a grande homologia que esta enzima tinha com a pepsina, que pertence à família A1 e ao clã AA é considerada a PAs arquétipo. Hoje é possível aceder a bancos de dados, introduzir a nossa sequência e obter a possível estrutura secundária da enzima. Bem, mas em relação à cardosina A vemos que se trata de uma enzima com estrutura rica em folhas beta, em ambas as subunidades. - Quer a subunidade maior, quer a menor possuem cerca de 46% da sua estrutura constituída por folhas beta e apenas 10% são hélices alfa. Curiosamente cerca de 40% estão dedicados a elementos sem conformação definida. Estará o sucesso da grande estabilidade desta enzima? Vemos a sequência conservada que rodeia os Asp catalíticos: DTG e DSG. Os aas conservados Tyr75 e Thr77, envolvidos no loop que fecha o local activo. Os locais de glicosilação Asn67 e Asn257 A estrutura é estabilizada por 3 pontes S-S. 2 na sub-unidade maior e 1 na menor. 2 sequências de adesão que mais tarde se verá como são importantes em mecanismos de interacção com outras moléculas. Uma em cada cadeia.

24 S`1 S3 S1 S`2 S`1 S2 S`3 Cardosina A

25 Pepsina Cardosina A

26 Gly76 S2 na cardosina e pepsina

27 Enzimas: local activo

28 ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
Enzimas: local activo Modelo do encaixe induzido ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.

29 ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
Enzimas: local activo ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.

30 O que se passa no local activo?
Enzimas: local activo O que se passa no local activo?

31 Para promover interacções efectivas com o substrato
Enzimas: local activo Para promover interacções efectivas com o substrato Ribulose-1,5-bifosfato

32 Definida pela estrutura 3D (ou 4D)
Enzimas: especificidade Definida pela estrutura 3D (ou 4D)

33 Enzimas: Cinética Enzimática
Modelo de Michaelis e Menten

34 Enzimas: Cinética Enzimática
Modelo de Michaelis e Menten V, varia com a [S] para uma concentração fixa de enzima [E0]

35 Enzimas: Cinética Enzimática

36 KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato
Enzimas: Cinética Enzimática ... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato

37 Enzimas: Cinética Enzimática
... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M Kcat - “turnover number”

38 Enzimas: Cinética Enzimática
Como medir a eficiência de uma enzima? ...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima) Perfeição enzimática Algumas enzimas aproximam-se destes valores...

39 Enzimas: Cinética Enzimática
Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução

40 Enzimas: Cinética Enzimática
Influência da temperatura e pH

41 Enzimas: Cinética Enzimática
Influência da temperatura

42 Enzimas: Cinética Enzimática
Influência do pH Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima

43 Enzimas: Cinética Enzimática
Influência do pH – Regula a actividade

44 Enzimas: Cinética Enzimática
Substratos múltiplos Reacções com transferência de grupos funcionais de um substrato para o outro... ...nas reacções de oxidação redução, são transferidos electrões Reacções que envolvem substratos múltiplos, classificam-se em duas classes: Deslocamento sequencial Deslocamento duplo

45 Enzimas: Cinética Enzimática
Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Todos os substratos têm que estar ligados antes da libertação de qualquer produto Dividem-se em duas subclasses: Sequencial ordenado Sequencial aleatório

46 Enzimas: Cinética Enzimática
Enzimas: Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Deslocamento duplo

47 Forma-se um complexo ternário
Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Num mecanismo sequencial ordenado, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto é importante Forma-se um complexo ternário

48 Enzimas: Cinética Enzimática
Enzimas: Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Num mecanismo sequencial aleatório, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto não é importante

49 Enzimas: Cinética Enzimática
Substratos múltiplos Deslocamento duplo Também designadas de reacções “ping pong” Um dos produtos é libertado antes de todos os substratos estarem ligados Neste tipo de reacções, forma-se um complexo enzima - substituída Um grupo funcional é transferido do primeiro substrato para a enzima O primeiro produto é libertado Liga-se o segundo substrato e o grupo funcional ligado à enzima é transferido para ele

50 Substratos múltiplos Deslocamento duplo
Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento duplo Catalisa a transferência de um grupo amina do aspartato para o -Cetoglutarato

51 Deslocamento sequencial
Enzimas: Cinética Enzimática Deslocamento sequencial ordenado Deslocamento duplo ?

52 Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores A actividade de diversas enzimas pode ser inibida pela ligação de pequenas moléculas específicas e de iões Algumas drogas e agentes tóxicos podem inibir o funcionamento de certas enzimas A inibição pode ser reversível ou irreversível

53 Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível O complexo enzima – inibidor dissocia-se rapidamente Dois tipos de inibição: Competitiva Não competitiva

54 Regulação e Inibidores Inibição reversível: Competitiva
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Competitiva

55 Regulação e Inibidores Inibição reversível: Não - Competitiva
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Não - Competitiva

56 Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível

57 Regulação e Inibidores Inibição reversível: Mista
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Mista

58 Quimosina+Pepstatina
Inibidor Gly76 Quimosina+Pepstatina Inibidor Gly76 C-terminal Loop flexível

59 Regulação e Inibidores Inibição irreversível
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente aos resíduos dos locais activos Desenho Racional de Fármacos ?

60 Quimosina Inibidor

61 Regulação e Inibidores Inibição irreversível
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Existem três classe de inibidores irreversíveis: Específicos de grupos Proteases tiólicas Ligam-se a cadeias laterais específicas

62 Regulação e Inibidores Inibição irreversível
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Marcadores de afinidade Moléculas estruturalmente semelhantes ao substrato e que modificam covalentemente o local activo Mais selectivos que os específicos de grupos O TPCK é um marcador de afinidade para a quimotripsina – DIAGNÓSTICO?

63 Regulação e Inibidores Inibição irreversível
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Inibidores suicidas São substratos modificados e são os mais específicos para marcar o local activo Ligam-se como se fossem substrato e o mecanismo catalítico normal é activado, produzindo uma espécie reactiva que posteriormente se liga covalentemente à enzima

64 INIBIDOR ? Regulação e Inibidores
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores INIBIDOR ? Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição

65 ? Regulação e Inibidores Biblioteca de péptidos
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição ? Moléculas que imitam o estado de transição do substrato, são inibidores potentes Biblioteca de péptidos

66 ? Como são feitos os estudos? PROPOSTA PELOS ALUNOS
Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores ? Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição Como são feitos os estudos? PROPOSTA PELOS ALUNOS