ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA.

Apresentação em tema: "ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA."— Transcrição da apresentação:

1 ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA

2 GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Os géis de poliacrilamida são usados para separação de proteínas e pequenos fragmentos de DNA e RNA (cerca de 5 a 500 pb). A poliacrilamida também pode ser usada quando pequenas quantidades de DNA ou RNA são analisadas ou quando é necessária uma maior resolução do que a obtida com o uso de géis de agarose.

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5 Principais vantagens do uso de géis de poliacrilamida
São formados por poros mais regulares e de tamanho uniformes Permite a aplicação de maiores quantidades de amostra; ate 10 ug de DNA podem ser aplicados, por exemplo, em um único poço sem perda significativa de resolução. São géis utilizados para a recuperação e a purificação de DNA e RNA, devido à relativa pureza de seus ingredientes. A acrilamida é uma matriz de gel mais resistente que a agarose, portanto, não quebra facilmente.

6 Características O gel de poliacrilamida é formado por um monômero de acrilamida (CH2=CH-CO-NH2) e por um cross-linker que copolimerizam em longas cadeias com ligação cruzadas covalentes. Dessa forma, é mais difícil de ser preparado e mais tóxico tanto em pó quanto em solução, relação à agarose.

7 Características O tamanho do poro do gel é determinado pela porcentagem total de acrilamida (entre 3,5 e 20%) e pela razão desta em relação a bisacrilamida, em geral um molécula de bisacrilamida para cada 29 monômeros de acrilamida. Caso as amostras a serem analisadas contenham uma mistura de ácidos nucleicos com grande variedade de peso molecular, é possível usar um gel com gradiente de concentração. Nesses géis, o topo apresenta poros de maior tamanho em relação aos da base do gel, tornando a corrida eletroforética mais restrita.

8 Materiais utilizados:
Cuba de eletroforese vertical; Placas de vidro, espaçador, grampos e pente para a montagem de um gel; Provetas; Pipetas graduadas; Pipetas semi-automáticas e ponteiras; Acrilamida a 40%; APS 10%; TMED; TBE 10x; Tampão de carregamento de amostra.

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11 Preparo do gel Desengordurar as placas de vidro.
Montar as placas utilizando grampos e espaçadores. Pipetar os seguintes reagentes: Reagentes Volumes ddH2O ,0 ml Acrilamida a 40% ,0 ml TBE 10x ,5 ml APS 10% µl TMED µl Volume final ,78 ml

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13 Colocar a placa montada em uma superfície plana e aplicar todo volume.
Colocar o pente após a aplicação do gel e aguardar por alguns minutos a polimerização. Retirar o pente e montar a placa na cuba eletroforética. Pipetar em cada poço 4 µl de amostra + 6 µl de tampão de carregamento de amostra. Ligar a fonte e colocar para correr a 100 w, 70 mÅ por 1’ 30”.

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