Projeto Tecnologias Moleculares e de Biossegurança para o Desenvolvimento Agropecuário TMBBA Sub-projeto: Estabelecimento e validação de metodologias de.

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1 Projeto Tecnologias Moleculares e de Biossegurança para o Desenvolvimento Agropecuário TMBBA Sub-projeto: Estabelecimento e validação de metodologias de detecção e análise de transgenes Equipe: – Vera Tavares de Campos Carneiro – Diva Maria de Alencar Dusi – Leila Maria Gomes Barros – Juliana de Almeida Dantas – Roberto Togawa – Daniele Scandiucci de Freitas – Ana Luiza Machado Lacerda – Filipe Pereira Fortes

2 Atividades do projeto - Inventariar transgenes existentes assim como informações relacionadas - Determinar sequências identificadoras de transgenes em geral e desenhar pares de primers específicos para amplificação por PCR, via bioinformática – Implementar método de PCR qualitativa para detecção de transgene – Implementar método de Real Time PCR para deteção de transgene de modo quantitativo – Implementar método de PCR múltipla para análise de múltiplos eventos - Validar os resultados de PCR por hibridização em membrana, sequenciamento de DNA ou captura em suporte sólido e deteção em espectrofotômetro

3 - Inventariar transgenes existentes assim como informações relacionadas Busca pela rede utilizando sítios de buscas e: http://www.agbios.com/dbase.php http://www.abc.org.br/ http://agenciact.mct.gov.br/index.php/content/view/44796.html http://www.bayercropscience.com.br/CP/novas_tecnologias/biotecnologia_1.asp http://www.ctnbio.gov.br/ http://www.cenargen.embrapa.br/ http://desearch.nal.usda.gov/ http://www.periodicos.capes.gov.br http://www.presidencia.gov.br/legislacao/ http://vm.cfsan.fda.gov/ http://www.rikilt.wur.nl/UK/

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5 Legislação LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005. Art. 1 o Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estímulo ao avanço científico na área de biossegurança e biotecnologia, a proteção à vida e à saúde humana, animal e vegetal, e a observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente. *Art. 27. Liberar ou descartar OGM no meio ambiente, em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio e pelos órgãos e entidades de registro e fiscalização: Pena – reclusão, de 1 (um) a 4 (quatro) anos, e multa. *Art. 29. Produzir, armazenar, transportar, comercializar, importar ou exportar OGM ou seus derivados, sem autorização ou em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio e pelos órgãos e entidades de registro e fiscalização: Pena – reclusão, de 1 (um) a 2 (dois) anos, e multa. Art. 40. Os alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de OGM ou derivados deverão conter informação nesse sentido em seus rótulos, conforme regulamento.

6 Critérios para liberação planejada de plantas transgênicas

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8 Plantas liberadas para plantio e comercialização Planta Característica Gene EventoPromotor/ terminador VetorObs AlgodãoResistência pragas da Ordem Lepidóptera Resistência à canamicina e neomicina Cry1Ac NPTII algodão Bollgard evento 531 FMV e 35SpV-GHBK04Monsanto do Brasil LTDA processo 01200.001471/2003-01 ParecerParecer 05/06/03 AlgodãoResistência a glifosatocp4epsps*ST4793R Stoneville Pedigreed Seed Co (Bayer). 26/09/02 AlgodãoTolerante glifosatocp4epsps1445FMV e 35S/ES Monsanto do Brasil LTDA AlgodãoResistência pragas da Ordem Lepidóptera e tolerância ao glifosato Cry1Ac e cp4epspsMon15985 x Mon88913 Figwort mosaic virus and 35S Monsanto do Brasil LTDA 23/08/01 Eucalipto Baixa ligninaInformação confidencial Arborgen Tecnologia Florestal Ltda / International paper do Brasil Liberação 21/06/07 Milho Zea mays tolerância ao glufosinato de amônio patT25CaMV 35S/ CaMV 35S pUC/AcBayer CropScience Ltda. nº: 01200.005154/1998-36 ParecerParecer 16/05/07 RevogaçãoRevogação 29/06/07 Milho Zea mays tolerância ao glufosinatopat 676, 678, 680 CaMV 35S/ PHP6710 Pioneer Sementes LTDA (Du Pont) nº 01200.002052/2002-05 Milho Zea mays tolerância ao glifosatocp4-epsps NK603CaMV/act-arPV-ZMGT32Dow Agrosciences Industrial Ltda N°: 01200.000667/2006-118/10/06 Monsanto do Brasil 26/09/02 Aventis Seeds Milho Zea mays Resistência a insetos e tolerante a herbicida glufosinato Cry1Ab/PAT Bt 11 CaMV35S / NOS pBSKStNovartis Seeds LTDA (Syngenta) Milho Zea mays Resistente a insetos e tolerante a herbicida VIP3A / PAT ICP4 pNOV1325Syngenta Milho Zea mays Resistência pragas da Ordem Lepidóptera e tolerância ao glifosato Cry1Ab MON810 35S e hsp70 maize / NOS PV-ZM BK07Monsanto do Brasil Soja Glycine max Resistência a glifosatop35S-CP4EPSPS- NOSt 40-3-2 CaMV35S/ NOSt PV-GMGT04 NCBI Monsanto do Brasil Soja Glycine max Tolerância a herbicidas do grupo imidazolinonas ahas ahas / ahaspBSKStEMBRAPA Soja 26/09/02

9 Plantas com pedidos na CTNBio para comercialização PlantaCaracterísticaGeneEventoPromotor/ terminador VetorEmpresa Algodãotolerante ao glifosinato de amônio. pat LLCotton25 Bayer CropScience Algodão ST4793R Tolerante ao glifosato (Algodão Roundup Ready). CP4EPSPS Monsanto Arroz LibertyLink Tolerante a glufosinato de amônia bar / Expressa pat LL Rice 6235S pB5 / 35Sbar Bayer CropScience Milho resistente a insetos da ordem Lepidoptera (Milho Guardian) Cry1Ab88017 Monsanto

10 Plantas liberadas para comercialização PlantaCaracterísticaGeneObservação MilhoResistência a lagarta do cartucho Tolerância a glufosinato Cry1Ab, Cry1Ac, Cry9C pat e bar Sementes importadas e liberadas para consumo animal. Plantas em pesquisa PlantaCaracterísticaGene PlasmídeoEmpresa/ grupo de pesquisa FeijãoResistência ao mosaico dourado (BGMV) Replicase (ac1) pBGMVRNAiAHASEmbrapa (Francisco Aragão) FeijãoResistência ao mosaico dourado (BGMV) Embrapa (Francisco Aragão) BeterrabaResistência a glifosatoCP4EPSPS Monsanto BatataResistência a víruscp PYV Embrapa

11 Plantas liberadas para comercialização no Exterior PlantaCaracterísticaGeneEventoObservação AbóboraResistência a vírusCapa proteica de CMV, WMV2 e ZYMV ZW-20Monsanto* (1995) AlfafaTolerância a herbicida CP4 epspsJ101, J163Monsanto (2005) AlgodãoResistência a lepdópteros Cry1AcMon531Monsanto (1996) Cry1Ac, cry2Ab2mon15986Monsanto (2003) cry1Fa, cry1Ac, pat281-24-236 x 3006-210-23Dow Agrosciences (2005) AlgodãoTolerância a herbicida CP4 epspsMon1445/1698Monsanto (1996) bar LLcoton25 Bayer CropScience (2005) Milho resistência a lepdópteros e tolerância a herbicida Cry1Ab/patBt11Syngenta * (1996) Cry1AbMon810Monsanto (1997) Cry1F, patTC1507Dow Agrosciences /Pioneer(2003) cry3Bb1mon863 Monsanto (2003) Cry3Bb1, cryAbMon863 x mon810Monsanto (2005) CP4 epspsGA21Monsanto* (1998) CP4epsps epspsNK603Monsanto (2001) patT14, T25Bayer CropScience* (1996) MamãoResistência a vírusCapa proteica PRSV55-1, 65-1Universidade de Cornel e Universidade do Havai (1998) Sojatolerância a herbicida CP4 epspsGTS 40-3-2Monsanto (1996)

12 Pesquisas Arroz enriquecido com vitamina A; alimentos com maior concentração de ferro e zinco; soja tolerante à seca. (Embrapa e Japão); tomate tolerante à seca; maracujá resistente a vírus; cana-de-açúcar resistente a vírus; frutas com longa vida de prateleira; produção comercial de uma variedade de arroz transgênico que produz proteínas do leite humano (Estados Unidos).

13 - Determinar sequências identificadoras de transgenes em geral e desenhar pares de primers específicos para amplificação por PCR, via bioinformática.

14 Desenho dos primers (ahas, cry1Ab, cry1Ac, CP4 epsps, pat, bar, promotor FMV, promotor 35S). >Glycinemaxtransgeniccp4epspsge TGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAA GATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCAC TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCT GACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAACAACATGGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTT CCATAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTTCTTGTTTTTGGATCTAAAAAACTGAAAAATTCAGCAAATTCTATGTTGGTTTTGA AAAAAGATTCAATTTTTATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGGCTACAGCCTGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGC CGGCCCGCAACCGCCCGCAAATCCTCTGGCCTTTCCGGAACCGTCCGCATTCCCGGCGACAAGTCGATCTCCCACCGGTCCTTCATGTT CGGCGGTCTCGCGAGCGGTGAAACGCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATACGGGCAAGGCCATGCAGGCCATGG GCGCCAGGATCCGTAAGGAAGGCGACACCTGGATCATCGATGGCGTCGGCAATGGCGGCCTCCTGGCGCCTGAGGCGCCGCTCGATTTC GGCAATGCCGCCACGGGCTGCCGCCTGACCATGGGCCTCGTCGGGGTCTACGATTTCGACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTCGCTCAC AAAGCGCCCGATGGGCCGCGTGTTGAACCCGCTGCGCGAAATGGGCGTGCAGGTGAAATCGGAAGACGGTGACCGTCTTCCCGTTACCT TGCGCGGGCCGAAGACGCCGACGCCGATCACCTACCGCGTGCCGATGGCCTCCGCACAGGTGAAGTCCGCCGTGCTGCTCGCCGGCCTC AACACGCCCGGCATCACGACGGTCATCGAGCCGATCATGACGTGCGATCATACGGAAAAGATGCTGCAGGGCTTTGGCGCCAACCTTAC CGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGCAAGCTCACCGGCCAAGTCATCGACGTGCCGGGCGACC CGTCCTCGACGGCCTTCCCGCTGGTTGCGGCCCTGCTTGTTCCGGGCTCCGACGTCACCATCCTCAACGTGCTGATGAACCCCACCCGC ACCGGCCTCATCCTGACGCTGCAGGAAATGGGCGCCGACATCGAAGTCATCAACCTGCGCCTTGCCGGCGGCGAAGACGTGGCGGACCT GCGCGTTCGCTCCTCCACGCTGAAGGGCGTCACGGTGCCGGAAGACCGCGCGCCTCCGATGATCGACGAATATCCGATTCTCGCTGTCG CCGCCGCCTTCGCGGAAGGGGCGACCGTGATGAACGGTCTGGAAGAACTCCGCGTCAAGGAAAGCGACCGCCTCTCGGCCGTCGCCAAT GGCCTCAAGCTCAATGGCGTGGATTGCGATGAGGGCGAGACGTCGCTCGTCGTGCGTGGCCGCCCTGACGGCAAGGGGCTCGGCAACGC CTCGGGCGCCGCCGTCGCCACCCATCTCGATCACCGCATCGCCATGAGCTTCCTCGTCATGGGCCTCGTGTCGGAAAACCCTGTCACGG TGGACGATGCCACGATGATCGCCACGAGCTTCCCGGAGTTCATGGACCTGATGGCCGGGCTGGGCGCGAAGATCGAACTCTCCGATACG AAGGCTGCCTGATGAGCTCGAATTCGAGCTCGGTACCGGATCCAATTCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTG AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTT ATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATA AATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGGATCGATCCCCCACCGGTCCTTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAGCGGTGAA ACGCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATACGGGCAAGGCCATGCAGGCCATGGGCGCCAGGATCCGTAAGGAAGG CGACACCTGGATCATCGATGGCGTCGGCAATGGCGGCCTCCTGGCGCCTGAGGCGCCGCTCG Busca de sequências no banco de dados (NCBI) Comparação (clustalw)

15 genePrimer/sequênciaTemperatura de anelamento Produto de amplificação HASFpahas 5'ACTAGAGATTCCAGCGTCAC3' 55°C685pb Rgahas 5'GTGGCTATACAGATACCTGG3' hasFahas168 5'GTCTGCCTGGGTACATTGC3’ 59.1°C168pb Rahas168 5’CAGTCAGCTCCACAAAGCG 3’ 60.8°C hasF104ahas 5’GTCTCTGCGCATGCTAGG 3’ 59.2°C104pb R104ahas 5'GTCACACGATCATCAAACCG3’ 60.0°C CP4 epspsFeps110 GGGTCTACGATTTCGACAGC 59.7°C 110pb Reps110 5’CTTCCGATTTCACCTGCAC3’ 59.2°C CP4 epspsFeps93 5’GACGTCACCATCCTCAACG3’ 60.1°C93 pb Reps93 5’GGTTGATGACTTCGATGTCG3’ 59.1°C cry1AcFc1ac111 5’CTCAACTAGGTCAGGGCGTG3’ 60.8°C 111 pb Rc1ac111 5'GCAAATTCTGTCCCGTCAAG3’ 60.6°C cry1AcFc1ac190 5’GTCTGTGATTCCGGGTGTC3’ 58.9°C190pb Rc1ac190 5’ GAACAACAAGGACCGAACG 3’ 59.1°C 35S F35S166 5’GGAAAGGCCATCGTTGAAG3’ 60.6°C166pb R35S166 5’ GGATAGTGGGATTGTGCGTC 3’ 60.3°C 35S F35S91 5’ CCAACCACGTCTTCAAAGC 3’ 59.3°C91pb R35S91 5’GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG 3’ 61.0°C

16 Principais métodos de detecção 1. Imunológicos: Kits (Bt-Express) Elisa Western Blot 2. DNA PCR

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