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Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline.

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Apresentação em tema: "Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline."— Transcrição da apresentação:

1 Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline

2 Origem de células T reguladoras no timo e na periferia Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66,

3 Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3

4 Existe uma rede transcricional que determina a expressão de foxp3 e outros genes relacionados às células T reguladoras?

5 Identificação molecular, estrutura e padrão de expressão do gene fkh (fox) As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo e portanto podem agir como um reguladores transcricionais

6 6 Subfamílias das protíenas Fox 15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia Kaestner, K. H., et al. Genes Dev :

7 Modificações pós-traducionais nos fatores de trancrição Foxo Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288 NES: Sequência de exportação nuclear NLS: sinal de localização nuclear

8 Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

9 Regulação dos fatores de transcrição FoxO Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

10 Regulação dos fatores de transcrição FoxO Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

11 Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição Indução de genes pró-apoptóticos Inibição de genes relacionados ao ciclo celular Indução da expressão de genes supressores de tumor ER: Receptor nuclear de estrógeno Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

12 Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

13 Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase de células T por Foxo1 Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

14 (Naive) (Ativadas) Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30,

15 Outra funções de proteínas FoxO em células T Peng, S. L. Oncogene (2008) 27,

16 Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo

17 Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, Controle molecular da diferenciação de células T reguladoras induzida por TGF-β

18

19 OBJETIVO Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.

20 Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- Expressão Foxo Score clínico Histologia 8 semanas A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal. ELISA

21 Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1 -/- Foxo3 -/- ? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- FACS 6 a 8 semanas A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4. CD4 CD8

22 Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1 -/- Foxo3 -/- ? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- 6 a 8 semans Isolamento CD4 (FACS) Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras do tipo Th1 e Th17. FACS PMA+iono (4h) FACS

23 Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1 -/- Foxo3 -/- ? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- FACS (timo e baço) 3 semanas timo baço timo baço Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço.

24 Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3? FACS WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- Tregs Cultura com FITC-VAD-FMK FACS 3 semanas Camundongos com 6 semanas As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.

25 WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 +/- Foxo1 +/- Foxo3 -/- Foxo1 -/- Foxo3 -/- Tregs CD4 naive – CFSE Anti – CD3 Esplenócitos irradiados (72h) FACS 3 semanas Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3? FACS CD4 T naive (4x10 5 ) Tregs WT Tregs Foxo1 -/- Foxo3 -/- (1x10 5 ) Rag1 -/- Mudança de peso Desenvolvimento de colite Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg. 6 semanas

26 Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 -/- Tregs baço (FACS) Extração e amplificação RNA Hibridização Affymetrix 603 sondas analisadas (genes assinatura Treg) 189 sondas com diferença de expressão (1.5) 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25 Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17) Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr) Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg independentemente da expressão de Foxp3. 3 semanas

27 Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos? Foxo1 -/- Foxo3 -/- (CD45.2) WT Tregs (CD45.1) (3x10 5 ) FACS (Treg e CD4) V CD4 Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs. 3-4 dias 8 semanas

28 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs? BM scurfy (2x10 6 ) BM WT BM Foxo1 -/- Foxo3 -/- (2x10 6 ) Rag1 -/- Sobrevivência FACS Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy. 6ª 8 semanas

29 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 -/- Isolamento CD4 timo Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h (TGF-β) Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) 3 semanas BM WT (2x10 6 ) CD45.1 BM Foxo1 -/- Foxo3 -/- (2x10 6 ) CD45.2 Rag1 -/- FACS Tregs timo Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo. 6ª 8 semanas

30 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia? WT (Foxo1 +/+ Foxo3 +/+ ) Foxo1 -/- Foxo3 -/- Isolamento CD4 periferia(naive) Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) 3 semanas Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por TGF-β.

31 Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição? WT Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3 + ) Preparação cromatina Incubação com Ab anti- foxo1 e anti-foxo3 3 semanas Precipitação com beads de proteína A agarose PCR do precipitado Anti-Foxo1Anti-Foxo3 rVISTA tool Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.

32 Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.

33 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? Animais com 3, 8 ou15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo CD44, CD69 Linfocitos CD4+ TCR + LN, baço

34 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfocitos CD4+ TCRb+ Incorporação de BrdU LN, baço Linfocitos CD4+ TCR + PMA+Ionomicina Elisa

35 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T. Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO HE- infiltrado celular Paralisia de membros posteriores

36 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? Animais com 3,8 ou 15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

37 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita. Soro

38 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi Citometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L Cxcr5-Tfh LN Baço

39 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6) Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi do LN RT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21. LN

40 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69. Fatores Foxo regulam 7Ilra

41 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f Cd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69.

42 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de alteração homeostática). Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

43 A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante? Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1 Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO Tcra-/- CD45.2 após 8 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3

44 A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante? Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs). Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3- Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+ Tcra-/- CD45.2 após 6 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3

45 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L. Timo

46 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? periferia Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127 Linfócitos CD4+ TCR + LN, baço Foxp3+

47 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L). Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos CD4+ TCRb+ Citometria de fluxo CTLA-4 LN Naive Estimuladas 3 dias Cd3 CD28 e TGF

48 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Proliferação CFSE Expressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGF ou não

49 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25, IFN-g após 3 dias de tratamento com TGF ou não

50 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L). foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN Citometria : Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGF CD3 e CD28

51 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T? Animais com 8 semanas CD4Cre- Cd4Cre foxo1f/f foxo3kca/kca HE- infiltrado celular Imunofluorescencia a dsDNA

52 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T? Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f Citometria de fluxo CD44, CD69 Linfócitos CD4+ TCR +

53 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T? Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

54 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T? Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para expressão e manutenção de Foxp3. Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f Linfócitos T CD4+ citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCR Treg periférica Timo LN foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f

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