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Fatores de transcrição Foxo e indução de

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Apresentação em tema: "Fatores de transcrição Foxo e indução de"— Transcrição da apresentação:

1 Fatores de transcrição Foxo e indução de
células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline

2 Origem de células T reguladoras no timo e na periferia
Development of nTregs and iTregs and the relevant markers associated with each. nTregs (top) differentiate from naïve conventional T cells to Foxp3+ Tregs in the thymus. In the periphery, natural Tregs express a number of cell surface markers, indicated in the box below the depiction of the natural Treg. However, none of these cell surface markers are unique to Tregs as they are also found on activated conventional T cells. Natural Tregs utilize the cytokines IL-10, IL-35 and TGFβ to exert their suppressive effects upon conventional T cells. TGFβ and IL-2 have also been shown to be important to the maintenance and fidelity of the Treg signature. iTregs (bottom) can be generated from conventional T cell precursors. Once in the periphery, naïve conventional T cells can be induced to become Foxp3− Tr1 cells or Foxp3+ Th3 cells via IL-10 and/or TGFβ secreted by APCs such as dendritic cells and macrophages. These induced Tregs share similar cell surface markers as natural Tregs. Foxp3+ induced Tregs can accumulate in the gut through upregulation of CCR9 and α4β7 via TGFβ and retinoic acid produced by CD103+ dendritic cells. TEC= thymic epithelial cell; Tconv= conventional T cell; DC= dendritic cell; RA= retinoic acid Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66,

3 Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3
Visto a importância da estabilidade na expressão de Foxp3 para a estabilidade do fenótipo de Tregs, várias vias de sinalização intracelular têm sido descritas como indutoras e sustentadoras da expressão de Foxp3. Sinais que são desencadeados pela ligação ao TCR, CD28, IL-2 e TGF-b e intracelularmente pelo aumento de cAMP, juntos regulam a expressão de Foxp3. Esses eventos resultam na ativação de fatores de transcrição que estão envolvidos na expressão de Foxp3, como CREB, ATF, SP1, NFAT, AP1, TIEG1, SMAD3 e STAT5. Entretanto a contribuiçao de cada via (inibição ou indução) podem diferir entre diferentes tipos de céls T, por exemplo, a sinalização por CD28 é importante para o desenvolvimento de nTreg no timo, enquanto a via PI3K-AKT-mTOR inibe a expressão de Foxp3 em céls T naive na periferia.

4 Existe uma rede transcricional que determina a
expressão de foxp3 e outros genes relacionados às células T reguladoras?

5 Identificação molecular, estrutura e padrão de
expressão do gene fkh (fox) As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo e portanto podem agir como um reguladores transcricionais

6 Subfamílias das protíenas Fox
15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia 6 Kaestner, K. H., et al. Genes Dev :

7 Modificações pós-traducionais nos fatores de
trancrição Foxo NES: Sequência de exportação nuclear NLS: sinal de localização nuclear FoxO post-translational modifications. (a) Schematic of the domains in FoxO3. NLS, nuclear localization signal; NES, nuclear export sequence. Amino acids are for human FoxO3. (b) Post-translational modifications of FoxO. The site numbers are for human FoxO family members. Note that mouse FoxO family members may have different numbering. (), Inhibition of FoxO; (þ), activation of FoxO; black, PTM verified in cells; blue, expected site based on sequence alignment with other FoxO family members; green, PTM verified in cells for the mouse FoxO, numbering for human FoxO based on sequence alignment; red, removal of PTM. Italics—PTM identified in vitro, not verified in cells. Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

8 Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos
Roles of FoxO transcription factors in cells and in the organism. FoxO transcription factors trigger a variety of cellular processes by upregulating a series of target genes (in italics). The cellular responses elicited by FoxO affect a variety of organismal processes, including tumor suppression, longevity, development and metabolism. Note that some cellular processes may not be exclusive to one organismal function (e.g. cell cycle arrest). Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

9 Regulação dos fatores de transcrição FoxO
FoxO factors are constantly shuttling between the cytoplasm and the nucleus (Brownawell et al., 2001).In the absence of insulin/growth factors, FoxO are mostly localized in the nucleus. (b) Activation of the PI3K–Akt/SGK pathway by insulin and growth factors triggers the phosphorylation of FoxO in the nucleus, the binding of the and the release of FoxO from their DNA-binding sites. (c) The binding of may lead to the exposure of NES and facilitate the interaction between FoxO and Ran/Crm1 at the nuclear pore. (d) In the cytoplasm, phosphorylated FoxO is degraded by proteasome-dependent degradation. NES, nuclear export sequence. Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

10 Regulação dos fatores de transcrição FoxO
Phosphorylation and translocation of Foxo proteins in response to growth signals and stress. Foxo protein phosphorylation at three conserved residues by growth factor-activated Akt through PI3K–PDK1 and mTORC2 kinases promotes the release of Foxo proteins from DNA, and their subsequent cytoplasmic translocation in a complex with proteins. By contrast, Foxo protein phosphorylation by stress-activated JNK or Mst1 kinases promotes Foxo protein nuclear translocation and activation even in the presence of Akt-dependent phosphorylation. Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

11 Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição
Indução de genes pró-apoptóticos Inibição de genes relacionados ao ciclo celular Indução da expressão de genes supressores de tumor Interaction between FoxO factors and other transcription factors. Examples of FoxO interaction with transcription factors at gene promoters to specify gene-expression programs. ER: Receptor nuclear de estrógeno Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

12 Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO
Possible model for a role of FoxO proteins as chromatin remodelers. In this model, FoxO proteins bind to compacted chromatin and open it by acting as chromatin remodelers (Hatta and Cirillo, 2007). FoxO factors can also bind to their binding sites in the promoters of specific genes to remodel chromatin in the vicinity of these sites as well to recruit a polymerase-containing complex to initiate gene transcription. Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

13 Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase
de células T por Foxo1 Foxo1 regulation of genes involved in T cell trafficking and homeostasis (a) Foxo1 promotes expression of trafficking molecules S1P1, CD62L and CCR7, and the homeostasis regulator IL-7Ra in naı¨ve T cells. Foxo1 enhances S1P1 and CD62L expression probably in part via its control of transcription factor KLF2 expression. Solid lines depict (representam) direct transcriptional activation, whereas dotted lines indicate potential direct regulation. (b) A feedback mechanism in the control of Il7ra gene expression. Signaling initiated by TCR, CD28, and/or IL-7 stimulation induces Akt activation that inactivates Foxo1 via phosphorylation, which results in downregulation of Il7ra gene transcription. Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

14 Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T
(Naive) (Ativadas) Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30,

15 Outra funções de proteínas FoxO em células T
Peng, S. L. Oncogene (2008) 27,

16 Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo
A ‘‘hit and run’’ model for thymic Treg cell differentiation. Thymocytes that receive low-affinity antigen stimulation are positively selected, and develop into conventional T cells. T cells do not express Foxp3 in the absence of nuclear NF-kB. Thymocytes that receive continuous high-affinity antigen stimulation are deleted by negative selection. T cells fail to express Foxp3 due to inactivation of Foxo proteins. Thymocytes with infrequent encounters with high-affinity antigens develop into natural Treg cells. High-affinity antigen stimulation in the presence of B7-activated CD28 signals activates NF-kB via IKK, and inactivates Foxo proteins via Akt. Upon cessation of antigen stimulation, Foxo proteins translocate back to the nucleus, and cooperate with NF-kB to induce Foxp3 gene transcription. Signals from the common g-chain cytokine IL-2 might also regulate Foxp3 expression. Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

17 Controle molecular da diferenciação de células
T reguladoras induzida por TGF-β Molecular control of TGF-b-induced Treg cell differentiation. NFAT and Stat5 activated by TCR and IL-2 signaling pathways respectively, and the Smad complex activated by TGF-b cooperate with Foxo to induce Foxp3 gene transcription. TCR stimulation inactivates Foxo via Akt-induced phosphorylation, whereas TGFb signaling probably maintains Foxo activity through undefined mechanisms (depicted as dotted lines). PTEN and Cbl-b promote iTreg cell differentiation through attenuation of PI3K activation. Although rapamycin inhibits mTORC1, it can also block mTORC2 and the consequent Akt activation to enhance Foxo activity and Foxp3 expression. Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

18

19 OBJETIVO Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.

20 Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- 8 semanas Expressão Foxo Histologia ELISA Score clínico A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.

21 Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- FACS 6 a 8 semanas CD4 CD8 A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4.

22 Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- 6 a 8 semans Isolamento CD4 (FACS) PMA+iono (4h) FACS FACS Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras do tipo Th1 e Th17.

23 Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
timo WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- FACS (timo e baço) 3 semanas baço Timo: diferenciação de tregs ---- menor no DKO Baço: DKO tem menos céls CD4 nos linfonodos (falhas na expressao de receptores de sobrevivencia e homing )em relação ao WT, mas no baço o numero de CD4 é igual para os dois Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço. timo baço

24 Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- Tregs Cultura com FITC-VAD-FMK FACS 3 semanas FACS Camundongos com 6 semanas As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.

25 Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- Tregs CD4 naive – CFSE Anti – CD3 Esplenócitos irradiados (72h) FACS 3 semanas FACS Camundongos rag sacrificados 6 semanas após a transferencia TRANSFERENCIA ADOTIVA EM RAG KO CD4 T naive (4x105 ) Tregs WT Tregs Foxo1-/-Foxo3-/- (1x105) Rag1 -/- Mudança de peso Desenvolvimento de colite 6 semanas Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.

26 Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- 189 sondas com diferença de expressão (1.5) Extração e amplificação RNA Tregs baço (FACS) Hibridização Affymetrix 603 sondas analisadas (genes assinatura Treg) 3 semanas 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25 Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg independentemente da expressão de Foxp3. Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17) Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)

27 Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos? Foxo1-/-Foxo3-/- (CD45.2) WT Tregs (CD45.1) (3x105) FACS (Treg e CD4) V 8 semanas 3-4 dias CD4 TRANSFERENCIA ADOTIVA EM CAMUNGA DKO Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.

28 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs? BM scurfy (2x106 ) BM WT BM Foxo1-/-Foxo3-/- (2x106) Rag1 -/- Sobrevivência FACS 6ª 8 semanas Nos primeiros exptos, o autor mostra que camundongos DKO, além de ter uma deficiencia nas Tregs, tb apresentam um aumento de CD4 e estas CD4 tem um drive pra Th1 e Th17, portanto não fica mto claro se a imunopatologia observada é completamente dependente da falta de tolerancia pelo defeito das tregs, ou uma maior ativação e/ou drive pra Th1 ou Th17 de CD4. Já nesse expto com camundongo scurfy, a imunopatologia é totalmente dependente do defeito de Tregs (menor diferenciação de tregs DKO), e não devido a outros fatores de células CD4. Ele faz este expto pra ver se as tregs DKO conseguem corrigir a imunopatologia nestes animais que não têm tolerância alguma, independente de outros fatores de CD4 presentes nos camundongos com deficiencia de Foxo1 e Foxo3. QUIMERRA DE BM DE SCURFY+BM DE WT OU DKO Tempo de sacrificio para o FACS????? In mice, a Foxp3 mutation (a frameshift mutation that result in protein lacking the forkhead domain) is responsible for 'Scurfy', an X-linked recessive mouse mutant that results in lethality in hemizygous males 16 to 25 days after birth.[11] These mice have overproliferation of CD4+ T-lymphocytes, extensive multiorgan infiltration, and elevation of numerous cytokines. Thisphenotype is similar to those that lack expression of CTLA-4, TGF-β, human disease IPEX, or deletion of the Foxp3 gene in mice ("scurfy mice"). The pathology observed in scurfy mice seems to result from an inability to properly regulate CD4+ T-cell activity. An analogous disease is also observed in a spontaneous Foxp3-mutant mouse known as “scurfy”. Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.

29 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo?
BM WT (2x106 ) CD45.1 BM Foxo1-/-Foxo3-/- (2x106) CD45.2 Rag1 -/- FACS Tregs timo 6ª 8 semanas WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- Isolamento CD4 timo Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h (TGF-β) Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) 3 semanas Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.

30 Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- Isolamento CD4 periferia(naive) Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) 3 semanas Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por TGF-β.

31 Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição?
rVISTA tool WT Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3+) Preparação cromatina Incubação com Ab anti-foxo1 e anti-foxo3 3 semanas Precipitação com beads de proteína A agarose PCR do precipitado Anti-Foxo1 Anti-Foxo3 Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.

32 Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.

33 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
LN, baço Citometria de fluxo CD44, CD69 Linfocitos CD4+ TCRb+ Animais com 3, 8 ou15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO

34 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN, baço Linfocitos CD4+ TCRb+ Incorporação de BrdU Linfocitos CD4+ TCRb+ PMA+Ionomicina Elisa

35 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO HE- infiltrado celular Paralisia de membros posteriores Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T.

36 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 3,8 ou 15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

37 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
Soro Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita.

38 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
LN Baço Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi Citometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L Cxcr5-Tfh

39 Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
LN Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi do LN RT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21. A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)

40 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Fatores Foxo regulam 7Ilra Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69.

41 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f Cd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69.

42 A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de alteração homeostática).

43 A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?
Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1 Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO após 8 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3 Tcra-/- CD45.2

44 Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).
A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante? Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3- Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+ após 6 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3 Tcra-/- CD45.2 Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).

45 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
Timo Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.

46 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
LN, baço Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127 Linfócitos CD4+ TCRb+ periferia Foxp3+

47 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN Linfócitos CD4+ TCRb+ Citometria de fluxo CTLA-4 Estimuladas 3 dias aCd3 aCD28 e TGFb Naive Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).

48 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Proliferação CFSE Expressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

49 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

50 Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Citometria : Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGFb, aCD3 e aCD28 Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L).

51 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas CD4Cre- Cd4Cre foxo1f/f foxo3kca/kca HE- infiltrado celular Imunofluorescencia a dsDNA

52 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f Citometria de fluxo CD44, CD69 Linfócitos CD4+ TCRb+

53 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
LN, baço Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

54 Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f foxo1f/f foxo3f/f Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f Timo Linfócitos T CD4+ citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCRb Treg periférica LN Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para expressão e manutenção de Foxp3.

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