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Fabrício Freitas Maria do Carmo Thiago Malardo. Leishmaniasis Leishmaniasis is caused by protozoan parasites belonging to the genus Leishmania. The parasites.

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1 Fabrício Freitas Maria do Carmo Thiago Malardo

2 Leishmaniasis Leishmaniasis is caused by protozoan parasites belonging to the genus Leishmania. The parasites are transmitted by the bite of an insect vector, the phlebotomine sandfly. Leishmaniasis threatens about 350 million men, women and children in 88 countries around the world. As many as 12 million people are believed to be currently infected, with about 1–2 million estimated new cases occurring every year.

3 Parasite's life cycle

4 – Cutaneous leishmaniasis - is the most common form. It usually produces ulcers on the exposed parts of the body, such as the face, arms and legs; – Diffuse (disseminated) cutaneous leishmaniasis - is characterized by the presence of a large (>10) number of lesions at several anatomic sites (head, limbs, and trunk); – Mucocutaneous leishmaniasis - the lesions can lead to partial or total destruction of the mucous membranes of the nose, mouth and throat cavities and surrounding tissues; – Visceral leishmaniasis - is the most severe form, in which vital organs of the body are affected. Forms of leishmaniasis

5 Global distribution of leishmaniasis BMJ VOLUME FEBRUARY 2003

6 Geographical distribution 90% of cutaneous leishmaniasis cases occur in Afghanistan, Brazil, Iran, Peru, Saudi Arabia and Syria; 90% of mucocutaneous leishmaniasis occurs in Bolivia, Brazil and Peru; 90% of all visceral leishmaniasis cases occur in Bangladesh, Brazil, India, Nepal and Sudan.

7 Geographical distribution of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in the New World

8 The main Leishmania species

9 Treatment regimens

10 Immune response against Leishmania

11 TLR and MyD88 pathway in Leishmania infection

12 TLR signaling pathway K. Takeda, S. Akira / Seminars in Immunology 16 (2004) 3–9

13 Events that lead to susceptibility

14 Events that lead to resistance

15 NATURE REVIEWS / IMMUNOLOGY / VOLUME 2 / NOVEMBER 2002 Resistance and susceptibility in leishmaniasis Suppressor of cytokine signalling (SOCS)

16 Thiago Malardo

17 Why some strains of Leishmania cause more severe injuries than others

18 Parasitized parasite Entamoeba histolytica (1960); Giardia lamblia (1986); Trichomonas vaginalis (1986); Most recently in Leishmania (1988).

19

20 Leishmania infected by virus Virus - Double-stranded RNA (dsRNA); Viruses of Leishmania have been identified in 13 strains of L. braziliensis or L. guyanensis; Are designated Leishmania RNA virus 1 (LRV1; Totiviridae).

21 Levels of RNA virus within the parasite affect the host`s immune response

22 Cutaneous leishmaniasis

23 Mucocutaneous leishmaniasis

24 Fabrício Freitas

25 Analisar o papel do TLR 2 e MyD88 na ativação de células dentríticas durante a infecção por Leishmania braziliensis Objetivo

26 A produção de citocinas e ativação das MyD88 -/- DC estão prejudicadas após a infecção por Leishmania braziliensis ? BMDC WT MyD88 -/- Infecção 8:1 L. braziliensis (Lb) L. amazonensis (La) Citometria de fluxo ELISA 24 horas

27 A produção de citocinas e ativação das MyD88 -/- DC estão prejudicadas após a infecção por Leishmania braziliensis ? Produção de IL-12p40 e ativação da DC foi prejudicada na ausência de MyD88.

28 Camundongos MyD88 -/- são mais susceptíveis à infecção por Leishmania braziliensis ? WT ou MyD88 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis semanalmente Lesão Camundongos MyD88 -/- são mais susceptíveis a infecção por L. braziliensis

29 Qual o mecanismo do MyD88 na susceptibilidade à infecção por Leishmania braziliensis ? WT ou MyD88 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis 4 e 8 semanas Linfonodo drenante 1x10 6 cels. 6 h Citometria CD4 + (IFN-γ, IL-17 e IL-10) O mecanismo do MyD88 é mediar a produção de céls. TCD4 + produtoras de IFN-γ e IL-17, sendo necessário para uma efetiva resposta imune contra L.braziliensis.

30 Toll 2 molécula chave na intereção hospedeiro-Leishmania.

31 Toll 2 está envolvido no reconhecimento da Leishmania braziliensis ? BMDC WT Toll 2 -/- Infecção 8:1 Citometria de fluxo ELISA 24 horas L. braziliensis (Lb) L. amazonensis (La)

32 Toll 2 está envolvido no reconhecimento da Leishmania braziliensis ? Na ausência de Toll2, DC são mais ativadas e produzem maiores quantidades de IFN-γ.

33 BMDC WT Toll 2 -/- Infecção 10:1 Real-Time PCR 4 horas L. braziliensis (Lb) L. amazonensis (La) O aumento da ativação de toll 2 -/- DC está associada com a expressão de SOCS após a infecção por Leishmania braziliensis ?

34 Na ausência de Toll2, DC expressaram maiores níveis de SOCS 1 e 3. Regulação positiva independente de toll 2.

35 Toll 2 -/- DC infectadas com Leishmania braziliensis podem ativar células T CD4 + produtoras de IFN-γ ? BMDC WT Toll 2 -/- L. braziliensis (Lb) L. amazonensis (La) Infecção 8:1 24 horas Co-cultura CD4 + baço 2x dias Proliferação ELISA

36 Toll 2 -/- DC infectadas com Leishmania braziliensis podem ativar células T CD4 + produtoras de IFN-γ ? A deficiência de toll 2 promove ativação da céls. T CD4 + e a produção de IFN-γ.

37 WT ou Toll 2 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis semanalmente Lesão Camundongos Toll 2 -/- são mais resistentes à infecção por Leishmania braziliensis ? Camundongos Toll 2 -/- são mais susceptíveis a infecção por L. braziliensis.

38 WT ou MyD88 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis 4 e 8 semanas Carga parasitária Como estaria a carga parasitária em camundongos Toll 2 -/- infectados com Leishmania braziliensis ? No grupo WT e K.O, houve semelhante carga parasitária na quarta e oitava semana.

39 WT ou MyD88 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis 4 e 8 semanas Linfonodo drenante 1x10 6 cels. 6 h Citometria CD4 + (IFN-γ, IL-17 e IL-10) A proteção em animais toll 2 -/- estaria associada com o aumento de céls. T CD4 + produtoras de IFN-γ?

40 A proteção está associada com um aumento da população de céls. T CD4 + produtoras de IFN-γ

41 A proteção em animais toll 2 -/- estaria associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4 + ? WT ou MyD88 -/- 2x10 6 Pata posterior L. braziliensis 4 e 8 semanas Linfonodo drenante 1x10 6 cels. SLA 3 dias Elisa (IFN-γ e IL-10)

42 A proteção em animais toll 2 -/- estaria associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4 + ? A proteção está associada com a alta produção de IFN-γ pelas céls. T CD4 +

43 Conclusão 2 A falta do MyD88 prejudica a imunidade protetora no combate à infecção por Leishmania braziliensis. Elevada ativação e produção de IL-12 e aumento na população de células T CD4 + produtoras de IFN-γ. PAPEL REGULADOR

44 Objetivo: Verificar a modulação da resposta imune por diferentes linhagens de Leishmania guyanensis e o envolvimento do LRV1 nesta modulação.

45 As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro? L.g.M+ L.g.M- M5313 BMMΦ (BALB/c) 6h DNA microarrays – expressão de genes (RI)

46 As linhagens L.g.M+ e L.g.M- modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro? L.g.M+ L.g.M- M5313 L.Major LV39 BMMΦ (BALB/c ou C57BL/6) 6h ELISA

47 Linhagens isoladas CL e CLM também modulam diferencialmente a resposta dos MΦ hospedeiro? L.g. h-CL (Lg1881) L.g. h-MCL (Lg1398) BMMΦ (BALB/c ou C57BL/6) 6h ELISA

48 L.g.M+ M5313 L.g. h-MCL (Lg1398) L.g.M- L.g. h-CL (Lg1881) Metastáticas Não- metastáticas CXCL10, CCL5, TNF-α e IL-6 Os elevados níveis de citocinas e quimiocinas, depois da infecção, estão associados com as linhagens de parasitas metastáticos.

49 A entrada do parasita e a formação de fagolisossomo são necessários para o desenvolvimento desta resposta? ELISA L.g.M+ L.g.M- M5313 BMMΦ (C57BL/6) Cloroquina ou Citocalasina D 6h

50 Existe envolvimento dos TLRs endossomais (TLR3, 7 e 9) nesta resposta? ELISA L.g.M+ L.g.M- M5313 BMMΦ C57BL/6 TLR3 -/- TLR7 -/- TLR9 -/- 6h

51 TLR3 é o receptor responsável pelo reconhecimento do parasita? ELISA (IFN-β) L.g.M+ L.g.M- M5313 BMMΦ C57BL/6 TLR3 -/- TRIF -/- MyD88 -/- 6h A via dependente de TRL3-TRIF foi essencial para o aumento da expressão dos mediadores proinflamatórios

52 Os MΦ reconhecem dsRNA das linhagens metastaticas? ELISA Ácidos nucléicos L.m.LV39 M5313 L.g.M+ L.g.M- BMMΦ BALB/c 6h ssRNAse ou DNAse/ssRNAse

53 L.g.M5313 (M+) L. guyanensis L. braziliensis Isolados de MCL humana dsRNA Leishmania RNA virus 1 (LRV1)

54 O LRV1 esta presente nas linhagens metastaticas? Ácidos nucléicos L.g.M- L.g.M+ M5313 L.g. h-CL (Lg1881) L.g. h-MCL (Lg1398) L.m.LV39 ssRNAse DNAse ou não RNA total Real Time PCR A B

55 O LRV1 é o responsável pelo aumento de citocinas e quimiocinas na infecção com linhagens metastáticas? dsRNA LRV1 Real Time PCR BMMΦ C57BL/6 TLR3-/-

56 Estes resultados são similares para linhagens isogênicas? Real Time PCR BMMΦ C57BL/6 TLR3-/- L.g.M4147-LRV high L.g.M4147-LRV neg

57 TLR3 e LRV1 desenvolvem o mesmo papel na leishmaniose in vivo? Carga parasitária (qRT-PCR) Camundongos C57BL/6 TLR3-/- TLR7-/- L.g.M+ L.g.M- Footpad swelling A B

58 Conclusão


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