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Furem a parede. Actividade realizada 1. Preparação de material e meios de cultura;

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1 Furem a parede

2 Actividade realizada 1. Preparação de material e meios de cultura;

3 MATERIAL & MÉTODOS É necessário saber: 1. A quantidade de material a utilizar (placas, tubos); 2. A quantidade de meios e reagentes necessários para a realizar; 3. O que deve fazer nos diferentes passos; 4. Tirar dúvidas antes de o realizar; 5. Limpar a bancada de trabalho com álcool de desinfecção, antes de iniciar cada actividade.

4 ACTIVIDADE 1. PREPARAÇÃO DE MATERIAL E MEIOS Os reagentes e meios de cultura a preparar são: 1. Preparação de Soro Fisiológico; 2. Preparação de TBX; 3. Preparação de LB Broth; 4. Preparação de LB agar; 5. Preparação de LB-10x; 6. Preparação de LB Top; 7. Tampão de conservação.

5 Para a realização deste desafio serão necessários aproximadamente 500 ml de Soro Fisiológico; 400 ml de TBX, 1 L de LB Broth; 4 L de LB Agar; 200 ml de LB-10x; 600 ml de LB Top; 500 ml de tampão de conservação.

6 A esterilização do material de vidro foi feito numa estufa ou forno a 180 ºC durante uma hora. Os tubos de ensaio foram fechados com folha de alumínio para evitar contaminações e só depois esterilizados na estufa. As pipetas de vidro foram colocadas em recipientes de vidro fechados com papel de alumínio.

7 Os meios de cultura líquidos foram esterilizados em autoclave durante 15 minutos a 1 atmosfera. Durante a manipulação das culturas, esteve sempre uma lamparina de álcool ligado.

8 MATERIAL A FORNECIDO Escherichia coli B; Tubos de microcentrífuga; Tubos falcon; Meio TBX desidratado; LB 10x Concentrado; Suplemento para o LB Top Agar (Solução A); Tampão de conservação.

9 OUTRO MATERIAL NECESSÁRIO: Componentes para a produção de LB Broth, LB Agar e LB Top: Triptona; Extracto de levedura; Cloreto de Sódio (NaCl); Agar-Agar. Água destilada Álcool de desinfecção; Pipetas de vidro de 10 ml e 1 ml; Placas de Petri; Tubos de ensaio de vidro com tampas de metal ou tapados com folha de alumínio dobrado em 4; Garrafas de plástico; Forno; Pompete; Lamparina de álcool ou bico de Bunsen; Ansa de microbiologia; Vareta ou pipeta de Pasteur de vidro; Banho-Maria ou estufa regulável a 37 e a 55 ºC; Balança; Magnetes; Placa de aquecimento ou fogão; Centrifuga (não é imprescindível).

10 PREPARAÇÃO DE SORO FISIOLÓGICO O soro fisiológico (solução salina), é utilizado em microbiologia para se efectuar diluições das amostras e/ou culturas bacterianas, já que se trata de um meio isotónico, evitando assim a ruptura das células bacterianas. Para a sua preparação foi necessários 9,5 g/L de NaCl.

11 MÉTODO: 1. Para um frasco autoclavável, com o dobro do volume final medir, 1 L de água destilada; 2. Pesar o cloreto de sódio; 3. Adicionar ao frasco e agitar até dissolver; 4. Esterilizar o soro em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos;

12 PREPARAÇÃO DE TBX O TBX (do inglês Tryptone Bile X-GLUC ) é um meio cromogénico e selectivo para o isolamento e contagem de Eschericia coli. Este meio é constituído por: Triptona 20 g/L; Sais Biliares 1,5 g/L; Agar-agar 15,0 g/L; X-glucoronídeo 0,075 g/L

13 MÉTODO: 1. Para um frasco com o dobro da capacidade, medimos 1 L de água desionizada; 2. Pesamos 36,6 g do meio TBX desidratado (fornecido); 3. Adicionamos ao frasco e fervermos o meio de cultura, em agitação, até que o agar estar dissolvido; 4. Esterilizamos o meio de cultura em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos; 5. Depois de autoclavar, deixaamos arrefecer até cerca de 50 ºC; 6. Em esterilidade, enchemos placas de Petri, previamente esterilizadas com aproximadamente 20 a 25 mL de meio de cultura (meia altura da placa); 7. Deixamos solidificar e marcamos as placas com "TBX"; 8. Deixamos a desidratar, à temperatura ambiente, em posição invertida, durante dois dias.

14 PREPARAÇÃO DE LB BROTH E LB AGAR O meio LB (Luria-Bertani) é o meio tradicionalmente utilizado para crescimento e manutenção de Escherichia coli. Ele pode ser utilizado sobre a forma de caldo (Broth) ou sobre a forma de meio sólido (agar), sendo neste caso necessário adicionar agar-agar. O meio LB é constituído por: Triptona 10 g/L; Extracto de levedura 5 g/L; Cloreto de sódio 10 g/L; Agar-agar 15 g/L (para o meio sólido)

15 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE LB BROTH 1. Para um balão Erlenmeyer medimos, 800 ml de água desionizada; 2. Pesamos o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sódio; 3. Adicionamos ao frasco e agitamos até dissolver; 4. Perfazemos o volume da solução a 1 L, adicionando água desionizada e agitamos; 5. Transferimos o meio de cultura para um frasco com o dobro da capacidade; 6. Esterilizamos o meio de cultura em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos;

16 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE LB AGAR 1. Para um balão Erlenmeyer medimos, 800 ml de água desionizada; 2. Pesamos o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sódio; 3. Adicionamos ao frasco e agitamos até dissolver; 4. Adicionamos 15 g de agar-agar, fervemos em agitação até que o agar estivesse dissolvido; 5. Transferimos o meio de cultura para um frasco com o dobro da capacidade; 6. Esterilizamos o meio de cultura em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos; 7. Depois de autoclavar, deixamos o meio arrefecer até atingir cerca de 50 ºC; 8. Em esterilidade, enchemos placas de Petri, previamente esterilizadas com 25 mL de meio de cultura (meia altura da placa); 9. Deixamos solidificar e marcamos as placas com "LB"; 10. Deixamos a desidratar, à temperatura ambiente, em posição invertida, durante dois dias.

17 PREPARAÇÃO DE LB-10X Numa amostra natural, os fagos estão presentes numa densidade muito baixa. Para que o seu isolamento seja possível, a sua concentração terá que ser aumentada, sendo portanto necessário proceder previamente à sua amplificação. Para tal, é necessário utilizar um meio de cultura em que as bactérias normalmente cresçam, só que este deverá estar 10x concentrado.

18 Para se preparar LB-10x é necessário1: Triptona 100 g/L; Extracto de levedura 50 g/L; Cloreto de sódio 100 g/L.

19 MÉTODO: 1. Para um balão Erlenmeyer medimos, 800 ml de água desionizada; 2. Pesamos o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sódio; 3. Adicionamos ao frasco e agitar até dissolver; 4. Perfazemos o volume da solução a 1 L, adicionando água desionizada e agitamos; 5. Transferimos o meio de cultura para um frasco com o dobro da capacidade; 6. Esterilizamos o meio de cultura em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

20 PREPARAÇÃO DE LB TOP Para se preparar LB Top é necessário: Triptona 10 g/L; Extracto de levedura 5 g/L; Cloreto de sódio 10 g/L; Agar-agar 4g/L; Suplemento para o Top Agar 20 ml/L (fornecido).

21 MÉTODO: 1. Para um balão Erlenmeyer medimos, 800 ml de água desionizada; 2. Pesamos o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sódio; 3. Adicionamos ao frasco e agitamos até dissolver; 4. Adicionamos o agar-agar; 5. Fervemos o meio de cultura, em agitação, até que o agar estivesse dissolvido. 6. Perfazemos o volume da solução a 980 ml, adicionando água desionizada e agitamos; 7. Transferimos o meio de cultura para um frasco com o dobro da capacidade; 8. Esterilizamos o meio de cultura em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos; 9. Depois de autoclavar deixamos arrefecer o meio de cultura até aproximadamente 50ºC; 10. Em esterilidade, adicionamos 20 ml do suplemento para o LB Top.

22 PREPARAÇÃO DE TAMPÃO DE CONSERVAÇÃO Para se preparar Tampão de conservação é necessário: NaCl 5,8 g/L; MgSO47H2O 2 g/L; Tris-HCl (1M, pH 7,5) 50 ml/L; Gelatina 2 g/L.

23 MÉTODO: 1. Para um balão volumétrico, medimos 800 ml de água desionizada; 2. Pesamos o NaCl e o sulfato de magnésio e dissolvemos nos 800 ml de água; 3. Adicionamos o Tris-HCl e a gelatina; 4. Fervemos a solução, em agitação, até que a gelatina estivesse dissolvida; 5. Perfazemos o volume da solução até 1 L, adicionando água desionizada e agitamos; 6. Transferimos para um frasco autoclavável com o dobro do volume. 7. Esterilizamos a solução em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos; 8. Em esterilidade, dividimos a solução por frascos mais pequenos, previamente esterilizados.


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