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Southern, Northern e Western Blot FISMA – FEA Curso de Biotecnologia Profa Cristina.

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Apresentação em tema: "Southern, Northern e Western Blot FISMA – FEA Curso de Biotecnologia Profa Cristina."— Transcrição da apresentação:

1 Southern, Northern e Western Blot FISMA – FEA Curso de Biotecnologia Profa Cristina

2 Eletroforese

3 A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho em Biologia Molecular. Em geral, DNA, RNA e proteínas podem ser separados segundo o seu tamanho numa matriz usando um campo elétrico aplicado. Na eletroforese em gel de agarose, o DNA ou o RNA é separado fazendo a amostra migrar através de um gel de agarose ou de poliacrilamida. As proteínas são normalmente separadas segundo o seu tamanho usando eletroforese em gel de acrilamida; também podem ser separadas segundo a sua carga eléctrica usando focagem isoeléctrica.

4 A técnica de Southern Blot O Southern blot é uma técnica que permite obter informação sobre a massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequência de DNA. A técnica, desenvolvida por Edwin Southern, é uma combinação de eletroforese em gel do DNA (este é frequentemente fragmentado por enzimas de restrição antes de fazer o Southern), transferência deste para uma membrana e hibridização com uma sonda marcada (radioativa ou fluorescente). Após a hibridização, a membrana é lavada para remover sonda não ligada a DNA e obtém-se uma imagem através de autoradiografia ou autofluorescência. A imagem obtida dá a(s) localização(ões) do DNA que liga a sonda, com a intensidade do sinal dando uma medida relativa da quantidade de DNA que hibridiza.

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7 Northern blot O Northern blot estuda o perfil de expressão de RNA mensageiro, onde, quando e quanto de determinado RNA mensageiro (correspondente à expressão de um determinado gene) está presente numa dada amostra. É uma das formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão a ser expressos em sistemas vivos. Neste processo, o RNA é separado numa eletroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma similar ao DNA no Southern blot.

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9 Western blot O Western blot usa o mesmo princípio do Southern blot e do Northern blot mas é aplicado a proteínas. Estas são separadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS).

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