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Carolina Magalhães Drielly Braite Fernanda Rodrigues Fernanda Valiati Mariana Brutschin Profª Fabiana Seixas, Dra.

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1 Carolina Magalhães Drielly Braite Fernanda Rodrigues Fernanda Valiati Mariana Brutschin Profª Fabiana Seixas, Dra.

2 Histórico Descoberta da Hereditariedade Genética baseada no melhoramento genético Século XX

3 Histórico – Século XX Genética molecular Citogenética Genética do desenvolvimento Genética do câncer Genética comportamental Surgimento de novas técnicas de estudo genético

4 Histórico Reconhecimento dos fatores genéticos na etiologia das doenças Genética clínica Área Promissora Imprintings Genômicos: As contribuições dos genomas materno e paterno podem variar e acarretar em doenças com fenótipos diferentes.

5 Diagnósticos de doenças Tratar, prevenir ou curar doenças genéticas Função e manifestação desses genes Mecanismos de hereditariedade Aconselhamento genético Banco de dados Por que estudar os genes?

6 Genômica Ramo da genética que estuda a natureza física e o funcionamento do material genético contido no conjunto de cromossomos de cada espécie Genômica Estrutural Determina a posição cromossômica e a sequência de bases dos genes de diversas espécies, incluindo a humana. Contribui para a detecção de mutação nos genes humanos. Genômica Funcional Descreve as funções dos genes Analisa como os genes estão sendo expressos ou silenciados.

7 Aplicações da genômica Desenvolvimento de testes para a detecção de mutações gênicas Exemplo: Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, que determinam as variantes hereditárias dos cânceres de mama e ovário.

8 Saúde MEDICINA Doença Baseada em testes genéticos e análises moleculares que permitem o conhecimento do mapa de predisposições genéticas de cada indivíduo. Baseada em testes genéticos e análises moleculares que permitem o conhecimento do mapa de predisposições genéticas de cada indivíduo.

9 Genome-Wide Association Studies (GWAS)

10 GWAS Escaneamento em equipamentos automatizados Deposição em chips de DNA Obtenção do DNA genômico Amostras de sangue ou esfregaço bucal Dois grupos de participantes Portadores da doençaSaudáveis

11 GWAS Levantamento do genoma de cada participante Busca por variações Variações com maior frequência em portadores

12 GWAS Variações associadas podem não causar diretamente a doença É necessário o sequenciamento de DNA da região do genoma em particular, a fim de identificar a exata modificação genética envolvida na doença.

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14 NHGRI GWA Catalog Published Genome-Wide Associations through 12/2010, 1212 published GWA at p<5x10 -8 for 210 traits

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17 Doenças Neurodegenerativas Deterioração do tecido nervoso na substância cinzenta do SNC Perda excessiva dos neurônios Neurônios são células do SN responsáveis pelo impulso elétrico

18 Identificação quanto a causa – esporádica/incidência familiar. Diagnóstico Avaliação da estrutura dos componentes do DNA. Diagnóstico Molecular Identificação das alterações dos genes ou marcadores biológicos suscetíveis a doença. Investigação Molecular Contribuição para o estudo. Alterações: Medula espinhal, músculos e nervos. Patologia

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20 Doença neurodegenerativa Progressiva Irreversível Afeta prncipalmente IDOSOS

21 Manifestações Clínicas: Perturbações de memória Declínio cognitivo Distúrbios comportamentais Perda de autonomia Pensamento abstrato

22 IDADE Fatores ambientais Eventos genéticos Grande problema de saúde pública! Afeta: cerca de 13% dos indivíduos com 65 anos ou mais % dos indivíduos com 80 anos ou mais

23 Neuropatologia: Placas amiloides, compostas por peptídeo amiloide- β ( Aβ) Emaranhados de neurofibrilas contendo proteína Tau hiperfosforilada.

24 Genes associados à Doença de Alzheimer DA de início precoceDA de início tardio APP PSEN1ApoE PSEN2 5% do total dos casos de DA95% do total dos casos de DA

25 APP (proteína precursora de amiloide) Localização : 21q21.2 Identificação a partir da purificação dos depósitos de peptídeo amiloide da placa neural. Apresenta 695 resíduos de AA, composto por 18 éxons.

26 APP Peptídeo amilóde Aβ - 42 Peptídeo amilóde Aβ - 40 SECRETASES!

27 APP é uma proteína trans-membrana Sua degradação anormal produz fragmentos peptídeos Aβ42 que se agregam e formam a placa neural

28 Mutações Mais de 32 mutações missense (não silenciosa) Sítios de clivagem das secretases Domínio trans-membrana nos éxons 16 e 17 V717I maior produção do peptídeo Aβ produção na forma Aβ42

29 PSEN1 (Presensilina 1) Localização : 14q24.3 Apresenta 12 éxons e codifica para uma proteína com 467 aminoácidos. São responsáveis pela clivagem da APP a partir da γ-secretase.

30 Mutações Mais de 176 mutações na PSEN1 - maioria missense. Aβ42 / Aβ40 Defeitos em PSEN1 : formas mais graves de DA penetrância completa início logo aos 30 anos de idade L166P Adolescência Elevada produção de Aβ42

31 PSEN2 (Presensilina 2) Localização : 1q42.13 Possui 12 éxons que codificam para um peptídeo de 448 aminoácidos.

32 Mutações Apenas 14 mutações foram relatadas I141N Perda do éxon 5 Aumento da proporção de Aβ42 sobre Aβ40

33 ApoE (Apolipoproteína E) Localização : 19q13.2 Composto por 4 éxons que codificam uma proteína de 299 aminoácidos. No éxon 4 há a presença de três isoformas proteicas ε2 (CIS/CIS); ε3 (CIS/ARG); ε4 (ARG/ARG)

34 Risco de desenvolver DA até os 85 anos: 4/ 455% 3/ 427% 3/ 3 9% ApoE 4 principal fator de risco para desenvolvimento da doença, representado em excesso nos indivíduos com DA. A herança de um ou dois desses alelos eleva até 5x a probabilidade de desenvolvimento da doença!

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36 Descobertas recentes:

37 GWAS - genome-wide association study Procura por SNPs Genoma de indivíduos portadores da doença Genoma de indivíduos normais Consórcio genético da doença de Alzheimer (ADGC) reuniu banco de dados de 9 coortes a partir dos 29 Institutos Nacionais do Envelhecimento (NIA)

38 MS4A4A, CD2AP, EPHA1, CD33 Nesse estudo foram identificados os genes MS4A4A, CD2AP, EPHA1, CD33 que são fatores de risco para a DA e comprovada a associação de genes anteriormente descobertos. Até o momento foram confirmados então 10 genes envolvidos com a DA de início tardio (ApoE, CR1, CLU, PICALM, BIN1, EPHA1, MS4A, CD33, CD2AP e ABCA7)

39 Diagnóstico Molecular

40 GENOTIPAGEM de ApoE

41 Um dos potenciais terapêuticos para o tratamento da DA seria a diminuição da produção ou o aumento da degradação do peptídeo beta- amiloide. Monócitos foram modificados geneticamente para expressar a enzima neprilisina (NEP) que é capaz de degradar esse peptídeo beta- amiloide. Terapia Gênica

42 Doença neurodegenerativa hereditária Autossômica dominante com penetrância Completa 5 a 10 casos por habitantes

43 Entre 35 e 50 anos Movimentos involuntários e anormais Distúrbios psiquiátricos Deterioração progressiva das funções cognitivas Demência depressão transtorno obsessivo- compulsivo ansiedade Manifestações Clínicas Raciocínio Lento Dificuldade de concentração, organização, decisão Perda de Memória

44 Corpo estriado Problemas com o movimento Córtex Problemas emocionais, cognitivos e psiquiátricos

45 Genes Associados Mutação região 4p16.3 Gene IT15, extremidade 5 repetições de trinucleotídeo Mutação instável – pai afetado Número de Poliglutaminas Idade de manifestação Fenômeno de antecipação raro – repetições

46 Antecipação genética /antecipacao_genetica.swf

47 Gene IT – análise de ligação, sonda G8 Primeiro gene responsável por doença localizado em humanos Codifica huntingtina

48 Huntingtina Presente em vários tecidos do corpoCérebro Cérebro: quase exclusiva do citoplasma neuronal axônios, dendritos e corpo celular Possíveis funções na célula: Migração vesicular e de exocitose de substâncias neurotransmissores e enzimas Mecanismos anti-apoptóticos

49 Alteração da função normal

50 Interações Celulares Proteína Mutante Cito- toxicidade Doença de Huntington

51 Hunting -tina Sp1 TAFII 130 Hunting -tina Sp1 TAFII 130 Expressão genes para transmissão neuronal Genes não são expressos Degradação e mudanças na função neuronal

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54 Fortes interações com HAP-1 Morte Celular

55 Disfunção e morte neuronal precoce Perda do suporte neurotrófico da BDNF do neurônio cortical para o estriado Disfunção Mitocondrial Agregados da proteína: citoplasma e núcleo Reciclagem Vesicular alterada Aumento da autofagia Transporte Axonal Prejudicado Desregulação transcricional

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57 Tratamento

58 Abordagens do Artigo Repressão da Huntingtina mutante através de RNAi Atrasar ou Impedir início dos sintomas em DH RNAi induzido por RNAs hairpin curto (shRNAs) a fim de reduzir a expressão de htt mutante e melhorar as anormalidades associadas a DH em um modelo de camundongo transgênico da doença.

59 RNAi direcionado contra o gene que codifica Huntingtina Reduz RNAm Reduz expressão da proteína em culturas de células e em células do cérebro do rato Melhora nas anormalidades comportamentais e neuropatológicas

60 Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) Doença de Lou Gehrig ou Doença de Charcot ELA Degeneração dos neurônios motores Sensibilidad e mantida Movimentos voluntários dos músculos

61 Cãibras e tremores muscularesAtrofia dos membros superiores e inferioresPerda de força muscular Manifestações clínicas

62 Eletroneuromiografia (EMG) Espirometria Ressonância Magnética Coleta do líquido cefalorraquidiano Diagnóstico

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64 Genes envolvidos com a ELA Principais genes estudados SOD1 FUS/TLS TARDBP 13 regiões do genoma denominadas ALS Apenas 10% da doença tem caráter genético

65 Região ALS1: SOD1 Função: Enzima Superóxido Disumutase - enzima antioxidante - conversão de íons superóxido em peróxido de hidrogênio Mutação: gera proteína com função altamente tóxica – incapacidade de dimerizar Cu e Zn Localização: braço longo do cromossomo 2

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68 Região ALS6: FUS/TLS Função: regulação de como os RNAs mensageiros são criados, modificados e transportados para produzir as proteínas Mutação: proteína encontrada aglomerada fora do núcleo – efeito tóxico Localização: cromosssomo 16

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71 Região ALS10: TARDBP Função: produz proteína TDP43 relacionada a regulação da expressão gênica Mutação: aglomerados da proteína tóxicos ou ligada a grupos for a do núcleo – apoptose dos neurônios Localização: braço curto do cromossomo 1

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75 Terapia Gênica Estudos realizados com camundongos transgênicos que expressam o gene SOD1 contendo a mutação G93A. Utilizou-se RNAi para impedir a tradução dos mRNA não ocorrendo a produção da proteína de conformação errada. Essa técninca utilizou como vetor os Lentivírus e obersevou-se como resultado um retardo do início dos sintomas da ELA.

76 Outros genes envolvidos…

77 Doença de Parkinson 2ª doença neurodegenerativa mais comum Afeta principalmente idosos > 50 anos de idade Prevalência aos 65 anos

78 Doença de Parkinson Crônica Progressiva Perda de neurônios dopaminérgicos da substância cinzenta do SNC. dopamina

79 Diagnóstico Tratamento Característica morfológica Corpos de Lewy Tratamento por controle dos sintomas

80 Manifestações Clínicas Após perda de 60% dos neurônios e diminuição de 80% da produção de dopamina Tremor Rigidez dos membros e do tronco; Bradicinesia ou lentidão dos movimentos; Instabilidade postural Diminuição do equilíbrio e da coordenação.

81 Causas Ação de neurotoxinas ambientais Produção de radicais livres Anormalidades mitocondriais Envelhecimento cerebral Predisposição genética

82 Susceptibilidade genética Forma esporádica 95% dos casos Etiologia multifatorial Fatores genéticos + ambientais Forma familiar 5% a 10% dos casosHistórico familiarFatores genéticos Autossômic a dominante Autossômic a recessiva

83 Genes envolvidos Alfa- sinucleína (SNCA) Parkin UCH-L1 PINK-1DJ-1LRRK2 GBAATP13A2

84 SNCA PARK 1 – SNCA 4q21.3 Herança: autossômica dominante Codifica para a alfa-sinucleína Proteína pré-sináptica 140 a.a Principal componente dos corpos de Lewy

85 SNCA Mutações: A53T e A30P Impedem degradação protéica pela alfa-sinucleína Produção de protofibrilas em células nervosas Ligação de protofibrilas em vesículas sinápticas Excesso de dopamina no citosol

86 MUTAÇÕES Agregados protéicos intracelulares (Corpos de Lewy) Células dopaminérgicas prejudicadas A presença de alfa-sinucleína, ubiquitina e subunidades proteassômicas nos corpos de Lewy sugerem o envolvimento da alfa-sinucleína na etiologia da disfunção do complexo ubiquitina-proteassoma na DP, o qual é essencial para a degradação de proteínas danificadas. A presença de alfa-sinucleína, ubiquitina e subunidades proteassômicas nos corpos de Lewy sugerem o envolvimento da alfa-sinucleína na etiologia da disfunção do complexo ubiquitina-proteassoma na DP, o qual é essencial para a degradação de proteínas danificadas. SNCA

87 Parkin PARK 2 – Parkin 6q Mutações são comuns 50% dos casos de DP Herança: autossômica recessiva

88 Mutações 95 já identificadas 40 rearranjos de éxons 28 deleções 14 multiplicações 43 SNPs 12 inserções e deleções Mutações mais frequentes: deleção do éxon 2, 3 e 4 mutações nos éxons 2 (255/256delA) mutação pontual no éxon 7 (924C>T)

89 Parkin Codifica para a parkina (ubiquinona) Envolvimento na via ubiquitina-proteassoma Presente nos corpos de Lewy Domínio RING UBIQUITINA – LIGASE E3

90 Degradação de proteínas danificadas Cadeias de poliubiquitina Ubiquitinação de proteínas danificadas Ubiquitina-ligase E3

91 MUTAÇÕES DISFUNÇÃO PROTÉICA FALHAS NA VIA UBIQUITINA- PROTEASSOMA ACÚMULO DE PROTEÍNAS DANIFICADAS NEUROTOXICI DADE APOPTOSE DE CÉLULAS NEURAIS DOENÇA DE PARKINSON

92 UCH-L1 PARK 5 – UCH-L1 4p14 Herança: autossômica dominante Codifica para a enzima hidrolase L1 ubiquitina carboxiterminal

93 UCH-L1 Hidrolase L1 ubiquitina carboxiterminal Enzima deubiquitinizante Hidrolisa cadeias de poliubiquitina em ubiquitina monomérica - RECICLAGEM Novos processos de ubiquitinação de proteínas danificadas

94 MUTAÇÕES DISFUNÇÃO DA ENZIMA FALHA NA RECICLAGEM DOS MONÔMEROS ATIVIDADE DA VIA UBIQUITINA PROTEASSOM A REDUZIDA NÃO DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNAS DANIFICADAS ACÚMULO DE PROTEÍNAS NEUROTOXICI DADE APOPTOSE DOENÇA DE PARKINSON

95 Outros genes envolvidos

96 5 novos genes

97 Meta-análise de sequências variantes de cinco estudos GWAS da doença de Parkinson dos EUA e Europa Objetivos: investigar as associações de loci previamente identificados e identificar novos loci de risco para a doença avaliar as consequências biológicas de variantes de risco identificadas, como SNPs Examinar a associação de alelos variantes, tanto com a expressão gênica quanto com a metilação do DNA.

98 Diagnóstico molecular Busca de marcadores de susceptibilidade Investigação molecular Escassez de informações sobre mecanismos moleculares Heterogeneidade de genes envolvidos É recomendada a realização de testes genéticos para a identificação de mutações no gene parkin em pacientes nos quais a doença tiver início antes dos 30 anos de idade.

99 Terapia gênica

100 Bibliografia Tobin A.J; Signer, E.R. Huntingtons disease: the challenge for cell biologists. Trends Cell Biol Dec;10(12): Li SH, Li XJ. Huntingtin-protein interactions and the pathogenesis of Huntingtons disease. Trends Genet Mar;20(3): Nasir, J; Goldberg,Y.P; Hayden M.R. Huntington disease: new insights into the relationship between CAG expansion and disease. Hum Mol Genet. 1996;5 Spec No: Lynn M. ; Genetics of Alzheimer Disease; J Geriatr Psychiatry Neurol December ; 23(4): 213–227. doi: / Bird, T. ; Genetic Aspects of Alzheimer Disease; Genet Med April ; 10(4): 231– 239. doi: /GIM.0b013e31816b64dc.

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