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Produção de Vitaminas. Introdução Substâncias orgânicas complexas. Geralmente presentes em pequenas quantidades em alimentos. Indispensáveis no metabolismo.

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1 Produção de Vitaminas

2 Introdução Substâncias orgânicas complexas. Geralmente presentes em pequenas quantidades em alimentos. Indispensáveis no metabolismo animal e vegetal. Inicialmente obtidas por extração, hoje em sua maioria por síntese Por fermentação: riboflavina (B 2 ), cianocobalamina (B 12 ), ácido ascórbico (C)

3 Cianocobalamina Sólido cristalino, vermelho intenso, inodoro, insípido, higroscópico, muito solúvel em água e etanol, insolúvel em solventes orgânicos. Decompõe-se rapidamente em pH alcalino e inferiores a 4,5. Ideal para aquecimento: pH 5,5 O radical DBI (5,6 dimetilbenzimidazol) é preponderante na atividade e deve ser fornecido ou preexistir na formação.

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5 Microorganismos Mais utilizados: Propionibacterium freundenreichii e P. shermanii e Pseudomonas (cepas especiais de P. denitrificans). Bacillus megaterium e Streptomyces olivaceus – mostos esgotados na obtenção de antibióticos ou de butanol e acetona. Rhodopseudomonas protamicus (engenharia genética) – alto rendimento sem adição de DBI ou estimulantes

6 Cepas de Propionibacterium P. shermanii ATCC Primeira metade em anaerobiose Manutenção em tubos de ensaio (g/L): triptona 10, extrato de levedura 10, suco de tomate filtrado 200, ágar 15; pH 7,2 – incubação 4 dias a 30ºC. Multiplicação (1ª fase): 400mL de mosto em erlenmeyers de 2L, mesmo meio de manutenção (sem ágar) – 48h, 30ºC sem agitação

7 Multiplicação (2ª fase): 10L (em fermentador de aço inox 30L) contendo (g/L) água de milho 20, glicose 90; pH 6,5, 24h, 30ºC, sem agitação. Manter o pH 6,5 com NH 4 OH. Fermentação: 340L (em fermentador de aço inox 500L) contendo (g/L) água de milho 40, glicose 100, CoCl 2.6H 2 O 0,02; pH 7,0, 30ºC. Primeiras 80h sem aeração (pequena pressão de N 2 ), agitação lenta. Nas 88h seguintes, agitação e pequena aeração. Manter o pH 7,0 com NH 4 OH. Rendimento: 30 a 40 mg de vitamina por litro.

8 Outros métodos Yongsmith e Chutima (1983): Propionibacterium sp imobilizadas em gel de alginato e incubadas em meio rico em fontes de C e H, contendo sulfato de cobalto, DBI e agente antiespumante (Tween 80), + 20mg/L em 5 dias, céls reutilizadas por 2 semanas. Patente Nippon Oil (1983): 65mg/L

9 Yongsmith e Apiraktivongse: resíduos de indústria de soja com P. freudenreichii em (g/L) glicose 10, extrato de levedura 5 a 10, riboflavina 0,05 e sal de cobalto

10 Cepas de Pseudomonas P. denitrificans – mínimo de 60mg/L (raças mutantes). Fornecimento durante toda fermentação, desde que haja adição de sal de cobalto, DBI e aerobiose intensa. Melaço de beterraba – contem betaína, aumenta o rendimento.

11 Merck e Co., Florent e Ninet (1979) P. denitrificans MB 2436 liofilizado em leite em pó. Inóculo em ágar inclinado (g/L): melaço de beterraba 60, extrato de levedura 1, caseína hidrolisada 1, (NH 4 ) 2 HPO 4 2, MgSO 4.7H 2 O 1, MnSO 4.H 2 O 0,2, ZnSO 4.7H 2 O 0,02, NaMoO 4.2H 2 O 0,005, água tratada qs.; pH 7,4, 96h 28ºC

12 Pré-cultura (erlenmeyer 1L): 150mL do mesmo meio sem ágar, 72h, 28ºC em shaker. Fermentação (dorna 5L): 3,3L de meio (g/L) melaço de beterraba 100, extrato de levedura 2, (NH 4 ) 2 HPO 4 5, MgSO 4.7H 2 O 3, MnSO 4.H 2 O 0,2, nitrato de cobalto hexahidratado 0,188, DBI 0,025, ZnSO 4.7H 2 O 0,02, NaMoO 4.2H 2 O 0,05, água tratada, pH 7,4

13 Esteriliza-se 75min a 120ºC, inocula-se com 150mL de pré-cultura. Fermentação por 90h a 29ºC, agitação e aeração

14 Separação Solubilização das cobalaminas e conversão em cianocobalamina com cianeto. Separação do substrato fermentado por centrifugação, lavagem com água e lise celular a 100ºC na presença de H 2 SO 4 diluído (pH=5). Vitamina na fase aquosa, secagem a vácuo, manter o pH 5 com sulfito de sódio.

15 Outro método Adsorção com Amberlite, Dowex, sílica gel. Eluição com água fenolada, ou mistura hidroalcoólica. Extração com fenol, cresol, ou cresol com benzeno ou butanol. Precipitação com acetona, ácido tânico ou p-cresol. Kureha (1985) – extração da massa fermentada com sol. hidroalcoólica contendo 0,01% de cianeto de potássio a 100ºC. Purificação em coluna Dowex pH 4.

16 Transferir para coluna de carvão ativado e separar a cianocobalamina eluindo com sol. aquosa de acetona a 75%. Transferir essa sol. a pH 3,5 para coluna de Amberlite e eluir com sol. de amônia pH 9. Passar a pH 7 em coluna de carvão ativado eluindo com sol. aquosa com 75% de acetona. Concentrar o eluato para cristalização com adição de acetona anidra. Extração de 92% com pureza de 99%

17 Riboflavina (B 2 ) Lactoflavina ou vitamina G. Sólido microcristalino amarelo-alaranjado, amargo e inodoro. Pouco solúvel em água e etanol (higroscópica) praticamente insolúvel em solventes orgânicos. Pouco mais solúvel em soro fisiológico do que em água. Resistente a ácido e ao calor, mas decompõe-se em meio alcalino ou na presença de luz. Pode-se usar riboflavina-5- fosfato de sódio: mais hidrossolúvel e mais de dois terços da atividade original.

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19 Microrganismos 3 processos: síntese total (20%), misto (50%) e fermentação total (30%). Misto: Bacillus pumilus mutantes ou B. subtilis. Fermentação total: Ashbya gossypii e Eremothecium ashbyii, Pichia guilliermondii e P. miso (fonte de carbono: hidrocarbonetos alifáticos) Recentemente: B. subtilis DNA recombinante

20 Bacillus pumilus mutantes B. pumilus IFO irradiado por ultravioleta. Meio de desenvolvimento (g/L): sorbitol 20, água de milho 20, fosfato monoácido de potássio 3, fosfato diácido de potássio 1, L-tirosina 0,1, L- fenilalanina 0,1; 24h a 36ºC

21 Fermentação (g/L): glicose 150, levedura seca 10, sulfato de amônio 5, carbonato de cálcio 20, L-triptofano 0,05, L-tirosina 0,05; L-fenilalanina 0,05; 60h a 36ºC. Filtração, concentração (50%), add etanol (25% do volume de caldo inicial). Eliminar precipitado e dessalinisar por troca iônica, tratar com carvão vegetal. Concentrar, add 4x o volume em etanol – cristalização da D-ribose (rendimento 70%)

22 Ashbya gossypii Mutantes por radiação ultravioleta (NRRL-Y 1056), otimização da solução nutriente e das condições fermentativas: 15g/L Fontes de carbono: glicose*, maltose e sacarose. Add água de milho sempre. Add lipídeos aumenta o rendimento.

23 Meio (g/L): água de milho 22,5, peptona comercial 35, óleo de soja 45. Outras peptonas, glicina (2g/L) e extrato de levedura aumentam o teor final. Inóculo pequeno (1%), 28ºC, aeração, antiespumante, 7 dias. Início pH 6,3 (ácido sulfúrico diluído), final pH 4,5. Tratar por 1h a 120ºC, separar o micélio e desprezá-lo

24 Hidrocarbonetos alifáticos ou DNA recombinante Pichia (P. miso e P. guilliermondii) alto rendimento (C10 e C18). Meio: n- hexadecano, uréia e água de milho; rendimento 51g/L (P. miso). Bacillus subtilis 304/pMx45 (DNA recombinante) – tempo muito menor (48h), rendimento baixo (3 a 6 g/L)

25 Separação Para ração animal: ajustar pH do vinho a 4,5, concentrar e secar. Para uso humano: acertar pH 4,5, aquecer 121ºC / 1h, centrifugar e desprezar a fração insolúvel. Tratar a solução com cloreto de titânio ou outro agente redutor; B2 reduzida precipitada é separada, reoxidada ao ar e dissolvida em HCl 10% a 60ºC. Após esfriar e neutralizar, cristalizar a riboflavina.

26 Ácido ascórbico Sólido branco, cristalino, inodoro e de sabor ácido. Solúvel em água, álcoois e acetona, insolúvel nos demais solventes inorgânicos. Sensível a luz e ao ar e resistente ao calor. Decompõe-se em pH acima de 5

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28 Fermentação clássica Reichstein e Grüssner: redução catalítica da glicose para D-sorbitol, fermentação deste para L-sorbose, e a partir daí por síntese química. Acetobacter suboxidans ou Gluconobacter oxidans (ATCC 621): sorbitoldesidrogenase. Meio (g/L): sorbitol 200, extrato de levedura ou água de milho 0,5% e carbonato de cálcio 0,5; 30 a 35ºC, vigorosa agitação e aeração, 24h, 180g/L L-sorbose 40mil T/ano a partir do dobro de glicose.

29 Erwinia e Corynebacterium Sonoyama (1982): substituição de quase todas as passagens químicas em duas passagens fermentativas: Oxidação de D-glicose a ácido 2-5 diceto-D- glucônico por uma cepa mutante de Erwinia (Erwinia sp ATCC 3126) Redução desse a ácido 2-ceto L-gulônico pela cepa mutante Corynebacterium sp ATCC 31090, com posterior transformação química em ácido L-ascórbico.

30 Primeira etapa Meio de manutenção (g/L): glicerol 5, extrato de levedura 5, peptona 3, fosfato diácido de potássio 1, sulfato de magnésio heptahidratado 0,2, ágar 20; 24h a 28ºC 1º estágio multiplicação (g/L): glicerol 5, água de milho 30, fosfato diácido de potássio 1, antiespuma 0,1; 20h a 28ºC, 275 rpm, 600mL em erlen de 2L

31 Aproveitamento de 94% em sal cálcico 2º estágio: 420L do mesmo meio inoculados com o conteúdo de 5 erlen (3L) em fermentador de aço inox de mil litros, 244 rpm e aeração 10h, 28ºC. Fermentação: 1860L mosto (g/L), glicose 58, água de milho 11,3, fosfato monoácido de amônio 5,6, carbonato de cálcio 184 e antiespuma 0,2; 28ºC, 160rpm, aeração e pressão, 26h. Da 3ª a 15ª hora: adicionar intermitentemente 1920L de sol. estéril contendo 1152kg de glicose.

32 Segunda etapa Meio manutenção (g/L): glicose 5, peptona 5, extrato de levedura 5, fosfato diácido de potássio 1, sulfato de magnésio heptahidratado 0,2, ágar 20; 28ºC, 40h. 1º estágio multiplicação (g/L): glicose 10, peptona 5, extrato de levedura 5, nitrato de sódio 1, fosfato diácido de potássio 1, sulfato de magnésio heptahidratado 0,2; 28ºC, 275rpm, 600mL em erlen de 2L

33 2º estágio 470L (g/L): glicose 10, água de milho 20, nitrato de sódio 2, fosfato diácido de potássio 1 sulfato de magnésio 0,2; inocular com 6L do meio anterior, 28ºC, 244rpm, aeração, 24h, fermentador de aço inox de 1000L Fermentação 4230L (g/L): glicose 20, água de milho 30, nitrato de sódio 3,45, fosfato diácido de potássio 0,67, sulfato de zinco 4,9x10 -3, cloreto de manganês 4,9x10 -3, cloridrato de tiamina 0,22x10 -3, D-pantotenato de cálcio 0,17x10 -3 e 470L do meio anterior; 66h, 160rpm e pequena aeração

34 Eficiência de 92% Primeiras 16h, adicionar 1g/L nitrato de sódio. Das 18 até as 66h, adicionar intermitentemente 2730L do produto esterilizado da fermentação com Erwinia contendo 847kg do 2-5-diceto-D- gluconato de cálcio e 154kg de glicose. Rendimento de ácido ascórbico 86% a partir do total de glicose consumida.

35 Outras vitaminas β-caroteno (provitamina A), biotina (vitamina H) e ergosterol (vitamina D2) Muitos estudos no sentido de encontrar métodos microbiológicos mais econômicos que os químicos.

36 Obtenção de β-caroteno Usualmente síntese química ou extração. Puro: cristais de cor vermelha, praticamente insolúvel em água. Moderadamente solúvel em éter etílico, de petróleo e óleos. Pouco solúvel em etanol e metanol. Solúvel em benzeno, clorofórmio e sulfeto de carbono. Fermentação: Ninet e Renault (1979) usando formas sexuadas de Blakeslea trispora.

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38 Blakeslea trispora NRRL 2456 (+) Blakeslea trispora NRRL 2457 (-) Cultura em ágar inclinado Cultura em ágar inclinado Pré-cultura Pré-culturas misturadas Cultura para produção Pré-cultura

39 Estocagem dos inóculos (esporos) em solo fértil. Culturas em ágar inclinado: 27ºC, 168h Pré-culturas: 26ºC, 48h, 400mL (g/L) água de milho 70, amido de milho 50, fosfato diácido de potássio 0,5, sulfato de manganês 0,1, cloridrato de tiamina 0,01; em erlen 2L agitação em shaker.

40 Mistura das pré-culturas (400mL de cada) com 120L do meio anterior em fermentador de 170L a 26ºC, 170rpm, aeração, 40h. Fermentação 320L (g/L): destilados solúveis 70, amido de milho 60, farinha de soja 30, óleo de algodão 30, antioxidante 0,35, sulfato de manganês 0,2, cloridrato de tiamina 0,5, isoniazida 0,6, querosene 20mL e água; pH 6,3. Mosto esterilizado a 122ºC por 55min, isoniazida e querosene separados.

41 Acrescentar 22L da mistura de pré-culturas, 26ºC, 210rpm, aeração, 55min, fermentador de 800L. Após 48h do início add 1g/L de b-ionona e 5mL/L de querosene. Continua e lentamente add 4,2g/L de glicose até o final. Isoniazida e b-ionona são ativadores, querosene solubilidade substrato hidrofóbico, antioxidante – baixa estabilidade do β-caroteno dentro da célula.

42 Separação Separar o micélio, introduzir metanol para retirar a água e extrair com cloreto de metileno 75-90% do produto bruto que pode ser purificado

43 Biotina Processos clássicos não mais utilizados hoje. Bacillus sphaericus e Rhodotorula glutinis. Rendimentos baixos. B. sphaericus pode produzir um análogo (Detiobiotina) que pode ser transformado em biotina por Aspergillus oryzae. Pó ou microagulhas incolores. Solúvel em álcool e em água alcalina ou quente. Insolúvel em solventes orgânicos. Puro é estável ao ar e à temperatura. Mais estável em soluções levemente ácidas que nas alcalinas.

44 Separação Filtrar o caldo fermentado para tirar os microrganismos e absorver a biotina em carvão vegetal ativo, eluir e purificar por cromatografia em coluna de troca iônica. O eluído é evaporado até a secura, a biotina bruta é recuperada, enxaguando com éter e purificando por recristalização com água ou álcool em pH 3,5

45 Ergosterol Por volta de 2% da biomassa seca em leveduras e fungos (na superfície das células) selecionados. Transforma-se em vitamina sob ação da luz ou especificamente dos raios ultravioleta. Cristais brancos praticamente insolúveis em água e muito pouco solúveis em etanol. Razoavelmente solúveis em éter e principalmente em clorofórmio. Fusarium sp. IFO 8889 (ATCC 20192), Cephalosporium coremioides IFO 8579, ou Trichoderma sp. IFO 635 – 0,65g/L palmitato de ergosterol e 0,2g/L ergosterol livre.

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47 Separação Centrifugar para separar a biomassa, extrair a fase líquida com ciclohexano, concentrar e diluir com clorofórmio, cromatografia em coluna de sílica, eluir com éter de petróleo, concentrar e cristalizar em etanol.

48 Outras espécies Johnson et al. (1994) – Rhodotorula glutinis IIP-3 (4%). Dulaney et al. (1954) – Saccharomyces cerevisiae MY 813: 3,8g/L. (OUT 7882)

49 Separação Nas leveduras o ergosterol está mais intimamente ligado à parede. Tratar a biomassa com amoníaco quente ou com uma amina, add metanol (remover impurezas), secar e filtrar. Extrair a massa com éter ou acetato de etila, após evaporação extrato com 90% de ergosterol e outras gorduras e outros esteróis. Saponificar e extrair os esteróis do insaponificável com éter etílico, recristlizar e separar por cromatografia.


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