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Dra. Márcia Melhem Seção de Micologia Instituto Adolfo Lutz Outros testes de sensibilidade a antifúngicos.

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1 Dra. Márcia Melhem Seção de Micologia Instituto Adolfo Lutz Outros testes de sensibilidade a antifúngicos

2 Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos Quando avaliar a resistência a antifúngicos Isolamento de um fungo Como realizar os testes Testes Problemas ainda existentes no método de referência... Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc Interpretação dos resultados de MIC ( g/mL) Sensititre YeastOne Resultado SDD Comparação de métodos Indicações do teste de sensibilidade Espécies Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade Considerações finais índice

3 Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos Difusão a partir de discos Difusão a partir de fitas Diluição em agar Diluição em meio líquido em tubos = macrodiluição em placas = microdiluição

4 Infecção ou colonização? Critérios microbiológicos e clínicos para indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos Quando avaliar a resistência a antifúngicos?

5 Levedura Fungo Filamentoso (bolor) Isolamento de um fungo

6 Microbiota humana transiente ou permanente (pele, mucosas, TR, TGI, TU) Microbiota transiente (pele, mucosas, TR) MICROBIOTA AGENTE ETIOLÓGICO MEIO AMBIENTE + MEIO AMBIENTE

7 Como realizar os testes? Manutenção Freezer a °c Plaqueamento Cultura mista é uma causa comum de erro! Colônia pura

8 Suspensão de células do fungo Solução- padrão= 10 6 ufc/mL Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual = INÓCULO Como realizar os testes? 1.Inóculo

9 Como realizar os testes? 2. Condições INÓCULO ANTIFÚNGICO (s) X = Sensibilidade Meio Líquido (caldo) Meio Sólido (agar) CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura

10 Método de Difusão por Discos Vantagens Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P) Fácil de realizar Similaridade com antibiograma Desvantagens Falta padronização para outras drogas Resultado somente em 3 categorias que não indicam pequenas alterações ou tendência para ® Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo... técnicas em agar

11 Método de difusão por fitas Vantagens: Resultado em CIM = MIC Facilidade de execução Disponível no comércio Desvantagens: Produto importado (custo) Trailling Leitura subjetiva Inóculo variável... técnicas em agar

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13 Diluição em ágar Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentrações de um AFG Inóculo na superfície (fungos de crescimento lento, dermatófitos, agentes de cromomicose) Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem sobre técnica de disco) Técnicas em agar fungo Placa com agar e afg ,5 ( g/mL)

14 Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ Agar com FZ (8 g/mL) Colônias pequenas: sensíveis Colônias grandes: resistentes Mas, requer ainda melhor avaliação com cepas R

15 Em tubos = macrodiluição ou macrométodo Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo Em tubos = macrodiluição ou macrométodo Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo Testes em meio líquido Método de Referência para leveduras (Candida spp e Cryptococcus neoformans) Doc. M27-A, NCCLS Método de Referência para leveduras (Candida spp e Cryptococcus neoformans) Doc. M27-A, NCCLS Método de Referência para Fungos Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium) Doc. M38-P, NCCLS Método de Referência para Fungos Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium) Doc. M38-P, NCCLS

16 Série de 10 tubos com várias concentrações do antifúngico + inóculo do fungo Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibição de crescimento Entre esses tubos, o que contém a menor concentração corresponde ao MIC Macrométodo

17 Micrométodo em placa MIC INÓCULOS CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO Controle de esterilidad e do meio Controle de crescimento dos inóculos Inóculos cepas ATCC

18 Automatização = resultados acurados Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64 g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8 g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados Determinação do MIC: Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12) Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento Automatização = resultados acurados Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64 g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8 g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados Determinação do MIC: Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12) Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento Micrométodo em placa

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20 Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)

21 Problemas ainda existentes no método de referência...

22 16 µg/ml ,12 0,06 C+ CIM 64 µg/ml ,5 0,25 C+ CIM AB 100% de inibição (NCCLS) 90% (EUCAST) Azóis 80% Inibição (MACRO) 50% de inibição (MICRO) Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc

23 E ainda... Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à anfotericina B - AMB. Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas condições de incubação (T, t, meio de cultura?) Outros métodos denominados NCCLS-like : Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das placas, etc...).

24 Interpretação dos resultados de MIC ( g/mL) Afg SSDDR FZ< > 64 IZ< 0,250,25-0,5> 1 AMB< 2-> 2> 2 S = sensível; R = resistente; SDD = sensibilidade dependente da dose: 100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro FZ 400 mg/dia= 20 ug/mL de soro 800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro NCCLS 2002

25 Sensititre YeastOne Indicador Alamar Blue (oxidação-redução) 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h negativo inibição parcial ( trailing) positivo Crescimento:

26 Resultado SDD Concentrações séricas de FCZ Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea ( g/mL)

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28 Comparação de métodos 5 cepas ATCC Correlação boa: AMB = 85 % FZ = 74 % Maiores erros: Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ® Nenhum indicou C.lusitaniae AMB® E-test (3/17) Microdiluição (14/17) [Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41] 17 laboratórios de Nova York, USA

29 Pfaller et al., 2003 E-test com azul de metileno MicrodiluiçãoDifusão por discos 235 cepas de Candida glabrata FZ = 91-96% VZ = 93-95% Pfaller et al., 2002 E-test 726 cepas de Candida sp Caspofungina = alta correlação, exceção C.lusitaniae Microdiluição Comparação de métodos

30 Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40 E-test Microdiluição 102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae Correlação E test x NCCLS VZ = 100% Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89% Comparação de métodos

31 Indicações do teste de sensibilidade Critério microbiológico: depende da identificação da espécie

32 Após a identificação da espécie Espécie reconhecidamente, resistente ® aos azóis ou anfotericina B 2.Espécie sensível

33 Espécies: 3 tipos ® ® INTRÍNSECA: todos os membros são ® Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida krusei frente ao fluconazol (FZ) Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não E para outros azóis? sim

34 ® NATURAL: alguns membros são ® Ex.: Candida glabrata ao FZ C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B (AMB) Espécies ® Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

35 ® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornam- se ® Ex.: C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espécies a FZ, itraconazol e cetoconazol Há indicação do teste de sensibilidade ? sim Espécies ®

36 Candida glabrata Desenvolve ® de modo muito rápido, poucas horas de exposição ao FZ. Não se recomenda tratar infecções caudadas por C.glabrata com FZ.

37 Espécies reconhecidamente, sensíveis Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de rotina, para a orientação terapêutica. A identificação da espécie, em regra, é suficiente para manter ou re-orientar tratamento.

38 Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade Paciente com histria de profilaxia com azól. Caso de falha terapêutica. Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

39 Considerações finais 1.Testes em agar podem ser úteis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rígido, com cepas-padrões e monitorados por um laboratório de referência (método NCCLS ou NCCLS-like). 2.Os métodos de referência não são aplicáveis a todas as espécies de fungos. 3.Não existe um método com boa sensibilidade para identificar cepas AMB ®. 4.A aplicação clínica de testes de sensibilidade a antifúngicos é limitada.


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