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UPCII M Microbiologia Teórica 23-24 2º Ano 2013/2014.

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1 UPCII M Microbiologia Teórica 23-24 2º Ano 2013/2014

2 Sumário T 23-24 MJC2 E. Patologia Oral de Etiologia Microbiana Capítulo XIX. Cárie Etiologia Bacteriana da cárie Modelos animais Imunologia da cárie e vacinas Aplicação de técnicas moleculares ao estudo da cárie Implicações para terapêutica 20-11-2013

3 Cárie – O que é? 20-11-20133T 23-24 MJC

4 Progressão da carie 20-11-2013T 23-24 MJC4

5 Tipos de carie Da superfície do dente Das fissuras ou zonas interproximais Radicular Recidiva Rampante Carie de biberão 20-11-2013T 23-24 MJC5

6 Etiologia Bacteriana Streptococci: mutans sanguinis gordonii sobrinus salivarius mitis anginosus.... S. mutans: a S. cricetus b S. ratti (us) c S. mutans d S. sobrinus e S. mutans f S. mutans g S. sobrinus 20-11-20136T 23-24 MJC Grupo IV Grupo II Grupo I Grupo III

7 Além dos streptococci …. Lactobacilli (dificuldade em colonizar superfícies lisas) Actinomyces 20-11-2013T 23-24 MJC7 Bifidobacterium, Propionobacterium, Veillonella, Attopobium Atopobium, Olsenella, Pseudoramibacter, Propionibacterium e Selenomonas Rothia, Propionibacterium

8 Factores de Virulência de Streptococci 20-11-2013T 23-24 MJC8

9 Factores de virulência de streptococci 20-11-2013T 23-24 MJC9

10 Glucanos e Frutanos 20-11-2013T 23-24 MJC10

11 Glucanos e Frutanos 20-11-2013T 23-24 MJC11

12 20-11-2013 Metabolismo da sacarose por S.mutans Glucosiltransferase Glucanos alfa(1,3) e alfa(1,6) + Frutose Fructanos beta(2,1) e beta(2,6) + Glicose Dextranase Fructanase PSI Fructosiltransferase T 23-24 MJCT09-10 12

13 Factores de virulência de S. mutans FactorFunçãoLocalização SpaP (AgB, AgI/II), PIAderência (saliva, aglutinina gp340)Superficie da célula Proteinas de ligação ao glucano (GbpA-C) Aderência aos glucanos (dentes e biofilme)Superfície da célula Glucosyl transferases (GtfB-D)Produção de polímeros de glicose apartir da sacarose (glucanos) Secretadas, muitas vezes associadas à parede Fructosyl transferase (Ftf)Produção de polímeros de fructose apartir da sacarose (fructanos – reservas extracelulares de glicose) Secretadas, muitas vezes associadas à parede FructanaseHidrólise dos fructanos. Aumenta e preserva a acidificação Secretadas, muitas vezes associadas à parede DextranaseHidrólise de glucanosSecretadas, muitas vezes associadas à parede Polissacarideos intracelularesPolímero intracelular de glicoseIntracelular Fosfoenolpiruvato:fosfotransfer ase (PTS) Cataliza internalização de vários açucares em baixas concentrações extracelulares Membrana/citoplasma ATPases (F1F0 ATPase ou H+ATPase) Complexo enzimático que bombeia H+ para fora da célula. Importância? F0 membranar F1 citoplasmático Tolerância ao ácidoVantagem competitiva em pH baixoGlobal e multifactorial 20-11-2013 13T 23-24 MJC

14 Biofilme e controlo do QS Os CSP 20-11-2013T 23-24 MJC14

15 Factores envolvidos 20-11-2013T 23-24 MJC15

16 Factores envolvidos 20-11-2013T 23-24 MJC16

17 Mais factores 20-11-2013T 23-24 MJC17

18 Fluor na prevenção da cárie 20-11-2013T 23-24 MJC18

19 Prevenção da carie 20-11-2013T 23-24 MJC19

20 Estudo das caries – Modelos animais Rat (ratazana) Tamanho Desenvolvem cárie segundo dieta (4 semanas) Modelos gnotobióticos e pathogen free 16-21 dias todos os molares infecção MI Alterações do esmalte Cães, gatos, cavalos, porcos. Primatas. 20-11-2013 20T 23-24 MJC

21 Técnicas de BM usadas 1. Clonagem de genes / Sequenciação 2. Mutações no cromossoma de S.mutans. Em que genes? 3. Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos. Quais? 4. Expressão de genes de virulência. 5. Expressão de genes em heterólogos. 6. Utilização de bactérias com moléculas repórter para a expressão de determinados genes. 20-11-201321T 23-24 MJC

22 1. Clonagem de genes Genes codificantes de proteínas extracelulares envolvidas na formação de polímeros de açucar. O que se sabia? Gtf e Ftf glucosiltransferase e fructosiltransferase O que não se sabia? Como eram regulados? Quantos genes existiam? Como é que as proteínas contribuiam para a virulência? 20-11-201322T 23-24 MJC

23 1. Clonagem de genes Quantos genes existiam? Existem 3 genes gtf diferentes em cada estirpe Existe 1 gene ftf 20-11-201323T 23-24 MJC

24 2. Mutação dos genes de S. mutans Como é que as proteínas contribuem para a virulência? Fazendo mutação dirigida Com os genes gtf e ftf mutados a capacidade de provocar patologia é bastante diminuida. 20-11-201324T 23-24 MJC

25 3. Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos Cada uma das enzimas têm domínios conservados Há dois domínios Um enzimático para a síntese do glucano Um de reconhecimento e ligação ao glucano (específico de mutans) 20-11-201325T 23-24 MJC

26 4. Expressão de genes de virulência Quando são os genes gtf activados? Quando há baixo pH 20-11-201326T 23-24 MJC

27 Outras questões além de gtf Síntese de polisacarídeos intracelulares de armazenamento Internalização dos vários açucares Proteínas de superfícies (AgI/II) Biofilmes 20-11-201327T 23-24 MJC

28 Caracterização das respostas ao stress Identificação dos genes Criação de mutantes Criar quimeras genéticas para observar o efeito das mutações. Para quê saber as respostas ao stress? 20-11-201328T 23-24 MJC

29 Respostas ao pH + 100 proteínas diferentes são expressas a pH 5.0 61 são bombas de protões ATPase Algumas são enzimas para produzir amónia intracelularmente. Como pode ser amonia produzida intracelularmente? Produção de S.mutans com urease do S.salivarius 20-11-201329T 23-24 MJC

30 PCR Isolamento de genes de função desconhecida. Cerca de 1/3 do genoma de S. mutans codifica proteínas de função desconhecida. Estudos de expressão por microarrays. 20-11-201330T 23-24 MJC

31 Microarrays Não servem para estudar proteínas cujo controlo é feito pós transcrição. Qual é a solução? 20-11-201331T 23-24 MJC

32 Vacinas contra cáries Produção sistémica de anticorpos memória S.mutans (superfícies sólidas) sIgA Resposta de curta duração Reforços Especificidade Etiologia Factores de virulência Adesão Formas de vacinação 20-11-201332T 23-24 MJC

33 Antigénios e modos de imunização Comprimidos de S. mutans inactivado Proteínas secretadas ou expressas por S.mutans Gtfs, Gbps, ag (I/II) e SpaP Disponibilização dos antigénio o máximo de tempo Tecido linfóide na associação da mucosa nasal e oral Peyers patches intestino Moléculas inteiras combinadas com partículas de alumínio, incluídas em esferas de poli-L-lactose. Actualmente partes das moléculas: Mais eficazes Mais fáceis de recombinar (junção da parte antigénica com toxinas aumenta longevidade da resposta) 20-11-201333T 23-24 MJC

34 Antigénios e modos de imunização Bactérias vivas (Salmonella enterica) Recombinante c/ agI/II + subunidade beta da toxina da colera. Administrado na mucosa nasal e no intestino 20-11-201334T 23-24 MJC

35 Segurança das vacinas Ensaios em humanos Soro de ratos imunizados com Strep. mutans reagia com tecido cardíaco. O material a ser utilizado como imunogénico tem de estar livre de material que possa ser prejudicial ao hospedeiro. 20-11-201335T 23-24 MJC

36 Resumo das estratégias de imunização 20-11-2013T 23-24 MJC36

37 Novas perspectivas Cárie tem etiologia microbiana mas... Polimicrobiana Há outros factores... Relação com o pH (bem estabelecida) mas poucas terapêuticas exploram este factor. Remineralização diminuída Conhecem-se alguns dos mecanismos associados à recuperação da dentina. Concentração dos iões necessários à reminenalização Terapêuticas inovadoras com Células estaminais Substituição de microrganismos não acidogénicos no biofilme oral 20-11-2013T 23-24 MJC37

38 Bibliografia T 23-24 MJC3820-11-2013 Capítulo 11 Capítulo 32 Capítulo 16-19


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