A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Universidade Federal de Pelotas

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Universidade Federal de Pelotas"— Transcrição da apresentação:

1 Universidade Federal de Pelotas
Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec Núcleo de Biotecnologia Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – Leite Belo Horizonte - 21/03/2013 Produção de Anticorpos Monoclonais contra Listeria monocytogenes para Utilização em Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos Marcelo Mendonça Médico Veterinário Doutor em Biotecnologia Pós-doutorando em Biotecnologia

2 Definição do Problema Listeria spp. – 8 espécies
Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi L. marthii, L. rocourtiae (Graves et al., 2010; Leclercq et al., 2010) Causador da Listeriose L. monocytogenes – Humanos e Animais L. ivanovii – Animais, casos esporádicos em Humanos (Guillet et al., 2010) Características A gênero Listeria consiste em 6 especies, mas somente Listeria monocytogenes é patogênica para o homem e também para animais. A infecção causada por este patógeno é a Listeriose, doença que causa sérios problemas em humanos e animais Listeria monocytogenes esta dividida atualmente em 13 sorotipos sendo que destes os sorotipos 1/2a,1/2b e 4b são isolados em surtos e casos esporádicos de Listeriose, fazem parte de um total de 90% de todas as cepas isoladas nestes casos. Bacilo Gram-positivo Anaeróbico facultativo Multiplicação (1°C a 45°C) Ubiquitário Todar, 2009

3 Orgãos de fiscalização - deteminam “Zero Tolerance”
Definição do Problema Presença de L. monocytogenes nos Alimentos Leite e seus derivados Produtos cárneos Vegetais e frutas (minimamente processados) Peixes e frutos do mar 123 pessoas 25 mortes (CDC, 2011) Listeria monocytogenes é uma bactéria gram-positiva que se apresenta em forma de um pequeno bacilo, são anaeróbios facultativo, não possui a capacidade de formar esporos. São bacterias que possui uma ampla faixa de crescimento, podendo se multiplicar em temperaturas de até negativo. Possuem motilidade positiva, mas que são expressos somente em temperaturas de -25, sendo um importante fator como identificação laboratorial Possuem também uma ampla faixa pH. Sendo essa um fator muito importante na alimentação de ruminantes por silagem, por suportar baixo pH E um outro fator que torna esse microrganismo tão resistente à situações ambientais adversas é sua capacidade de tolerar altas concentrações de sal de 10% ou superiores até 20% algumas literaturas trazem... Listeria monocytogenes é um microrganismo ubíquo , ou seja, esta amplamente presente em diversos locais na natureza, como solo, agua, plantas vegetais fezes e silagem. Isso traz um grande perigo de contaminaçao em toda a cadeia alimentar, desde o inicio com a produção na fazenda, com a contaminação de animais, passando por plantas de processamento de alimentos, como frigorificos, laticinios. E Também no ambiente doméstico onde há relatos de isolamento desta bactéria em geladeiras. A alta capacidade de suportar varias situações adversas como tolerância ao sal e acidez, sua capacidade desenvolver em temperaturas baixas, dendo até suportar congelamento, leva consequentemente a contaminação de inúmeros alimentos Orgãos de fiscalização - deteminam “Zero Tolerance” Prontos para consumo - Ready-to-eat (RTE) foods

4 Método de Diagnóstico para L. monocytogenes
Definição do Problema Método de Diagnóstico para L. monocytogenes Metodologia convencional utilizada para detecção em alimentos 37ºC / 48h 37ºC / 24 a 48h 30ºC / 24h 37ºC / 24h OXFORD LEB FRASER TSA-YE enriquecimento PALCAM Pré-enriquecimento Os métodos de diagnóstico utilizados para detecção de Listeria em alimentos ainda são considerados gold standard e são utilizados pela grande maioria dos laboratórios e aceitos pelos orgãos de fiscalização. Esses métodos geralmente se utilizam de meios de pré-enrequicimento e recuperação celular, enrequecimentos seletivos, agares e provas bioquimicas. Mas esses métodos são Laboriosos, como pode ser visto levam vários dias para ter um resultado da especie monocytogenes. 5 – 10 dias Mais dias! -hemólise Catalase Fermentação de carboidratos Motilidade 24 – 48h Farber e Daley, 1995 7 dias 24h

5 Solução do Problema e Diferencial Anticorpos Monoclonais (MAbs)
Métodos rápidos de diagnóstico de L. monocytogenes - Desejáveis Técnicas de Imunoensaios Alta sensibilidade, Especificidade e Reprodutíveis Anticorpos Monoclonais (MAbs) MAbs são imunoglobulinas secretadas por clones de células (hibridomas) que são obtidas através da fusão in vitro de linfócitos B produtores de anticorpos com células de mieloma (Linfócitos B tumorais)

6 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Após 6 Fusões Celulares – Listeria MAbs 7 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria monocytogenes MAbs anti-InlA - 2D12, 3B7 e 4E4 Maior reatividade com Internalina A nativa 4 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria spp. MAb anti-proteína p30 - 3F8 Reconhece exclusivamente o gênero Listeria

7 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
ELISA indireto

8 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot MAb 2D12 anti-InlA de Listeria monocytogenes

9 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot MAb-3F8 anti-Listeria spp. – Proteína de 30 kDa (p30) Reação com L. monocytogenes e L. marthii L. monocytogenes F4244 L. marthii Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Salmonella typhimurium Bacillus thuringiensis E. coli O157:H7 Lactococcus lactis Enterococcus aerogenes Lactobacillus paracasei Klebsiella pneumoniae Enterococcus faecalis 35 27 Revelado com DAB

10 Estágio de desenvolvimento da tecnologia Separação Imunomagnética
Immunomagnetic Separation (IMS) Separação e concentração do microrganismo alvo Ligação dos anticorpos em esferas magnetizadas Fonte: Bhunia, 2008

11 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Eficiência de captura com diferentes [ ] em PBS MAb-2D12 (InlA) 108 a 103 UFC/mL Diferença na captura entre anticorpos MAb-2D12 (InlA) MAb-3F8 (p30 - gênero Listeria) Dynabeads anti-Listeria (Invitrogen)

12 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Separação Imunomagnética (IMS) Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Queijo de Cabra - artificialmente contaminado 10 mL L. monocytogenes 4b L. innocua ~ 1 UFC/g 10 g de Alimento + 90 mL Caldo Fraser 16 h a 37oC IMS Contagem em Placa

13 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Biossensor de Fibra Óptica Formato Sanduíche Captura e Detecção Fibras de poliestireno - 5 cm Sinal em tempo real

14 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Imunoseparação Magnética seguido por Sensor de Fibra Óptica Queijo de Cabra - artificialmente contaminado Co-cultivo L.monocytogenes e L. innocua IMS seguido de ensaio com Fibra Óptica MAb-2D12 marcado Cy-5 InlA de L. monocytogenes Tempo Total da IMS + Fibra Óptica Aproximadamente 21 horas

15 Potencial de mercado

16 Potencial de mercado Diferenciais propostos em nossos estudos em comparação aos outros: Brasil gastou mais de 1 bilhão de reais entre 2008 e 2010 com importação de anticorpos monoclonais (Reis et al. 2011) A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada - UFPel demonstraram-se altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano Utilização de MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de identificação de L. monocytogenes pode ser reduzidos para 48h ou menos Desenvolvimento e implementação de plataformas de testes rápidos para detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos recombinantes previamente produzidos e caracterizados na UFPel Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar outras plataformas, que poderão ser empregadas no desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico para outras enfermidades importantes A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos. A metodologia tradicional de identificação de L. monocytogenes em alimentos pode demandar até 10 dias para ter o resultado final. Com os testes de diagnóstico utilizando MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de identificação podem ser reduzidos para 48h ou menos. Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada demonstraram-se altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano. A proposta prevê o desenvolvimento e implementação de uma plataforma de testes rápidos para detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos recombinantes previamente produzidos e caracterizados no Núcleo de Biotecnologia, CDTec-UFPel. Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar uma plataforma, que poderá ser empregada no desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico para outras enfermidades importantes no Rio Grande do Sul e em outros estados brasileiros.

17 Equipe de colaboradores – Listeria MAbs
Primeira e Segunda Parte do Projeto – Produção dos anticorpos e plataformas Prof. José Antonio Guimarães Aleixo (Imunologia e Microbiologia de Alimentos) Prof. Wladimir Padilha da Silva (Microbiologia de Alimentos) Prof. Arun K. Bhunia - Purdue University/USA (Imunologia e Biologia Molecular) Prof. Fabricio Rochedo Conceição (Imunologia e Biologia Molecular) Profa. Ângela Nunes Moreira (Imunologia e Microbiologia de Alimentos) Segunda Parte do Projeto – Produção das plataformas Prof. Odir Antonio Dellagostin (Biologia Molecular e Bioinformática) Prof. Alan John Alexander McBride (Biologia Molecular e Proteômica) Mestrando Gustavo Schmidt Garcia Moreira (Imunologia e Bioinformática ) Doutoranda Karla Sequeira Mendonça (Microbiologia e Biologia Molecular)

18 Marcelo Mendonça Obrigado! marcelomendoncavet@yahoo.com.br
(53) /

19 Slides Extras

20 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Fusão Celular Extrato total proteínas de L. monocytogenes

21 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Listeria monocytogenes expressando GFP MAb-2D12 anti-rInlA Mendonça et al – BMC Microbiology

22 IMS Queijo BHI Plates Modified Oxford MAb- 2D12 Dynabeads MAb-2D12 Dynabeads MAb-3F8 MAb-3F8 > 105 UFC.mL-1 Fibra Óptica – 103 UFC.mL

23 Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Queijo de cabra artificialmente contaminado L. monocytogenes + L. innocua PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes

24 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot L.monocytogenes F4244 L. marthii L. welshimeri E. coli O157:H7 L. innocua F4248 Dois MAbs juntos Identificação específica Gênero e espécie 2D12 - InlA 100 75 Revelado com DAB 7.5% SDS-PAGE 37 3F8 - p30 25

25 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Imunofluorescência MAb 2D12 Anti-InlA L. monocytogenes 4b (F4244) L. monocytogenes 4b (F4244) L. monocytogenes 4d (19117) L. monocytogenes 4d (19117) L. innocua 6a L. innocua 6a

26 Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot MAb-3F8 anti-Listeria spp. Reação com todos os sorotipos de L. monocytogenes 1/2b (F4260) 1/2c (7644) 1/2a (V7) 3a (19113) 4a (19114) 4b (F4244) 4e (19118) 4ab (murray) 3b (2540) 3c (2479) 4c (19116) 4d (19117) 7 (1323) 35 27 SDS-PAGE 10% - Western blot PVDF Revelado com DAB (3,3'-Diaminobenzidine)

27 Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Salsichas tipo hotdog artificialmente contaminado 10 g de hotdog + 90 mL Fraser L. monocytogenes 4b e/ou L. innocua Após IMS Plaqueado em agar BHI PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes

28

29 Após entrar no organismo e vencer a barreira intestinal
LISTERIOSE Cérebro Placenta População de risco: Indivíduos imunocomprometidos Mulheres grávidas Idosos e crianças Adultos saudáveis (imunocompetentes) Baixa morbidade - Alta mortalidade Taxa de mortalidade: 30% da população suscetível Após entrar no organismo e vencer a barreira intestinal Fígado Baço Septicemia, Meningite, Meningoencefalite L. Monocytogenes fígado e baço Entretanto, escapa e migra pelo organismo… Septicemia SNC Placenta A Listeriose, a bacteria tem um tropismo pelo sistema nervoso central, útero e sistema circulatorio, do hospedeiro podendo causar uma septicemia, meningite e meningoencefalite. Fora essas, Listeria pode causar vários outras sindromes relacionadas com a infecção. Esta enfermidade possui uma baixa morbidade na população mas cursa com uma alta mortalidade, podendo alcançar até 30% na população suscetivel. Dados dos CDC dos USA relatam que anualmente ocorra 2500 casos de listeriose e que deste aprox 500 evoluam para óbito. Só que certos segmentos da população são mais suscetíveis a infecção por Listeria monocytogenes Individuos com algum comprometimento do sistema imune, como pacientes de transplante, com cancer, AIDS, possuem maiores chances de contrair Mulheres grávidas pelo seu estado fisiológico possuem uma maior chances em contrair a enfermidade. Tem um grnade tropismo pelo utero a bactéria tem uma tem a capacidade de romper a barreira transplacentária e causar um aborto ou nascimento de bebê gravemente doente. Assim como Idosos por ter a depleção do sistema imune e crianças por não ter o sistema imune ainda bem formado também possuem autos riscos de contrair Listeria Quando pessoas saudaveis se infectam geralmente o sistema imune consegue dar conta, e a enfermidade cursa como um caso de infecção alimentar como por outras bacterias com diarreia, dores de cabeça e corpo, febre, vômito. Mas em casos em que a ingestão de grande quantidade de bactéria pode vir causar sintomas mais sérios como meningite Aborto Natimorto Nascimento criança doente


Carregar ppt "Universidade Federal de Pelotas"

Apresentações semelhantes


Anúncios Google