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Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec Núcleo de Biotecnologia Marcelo Mendonça Médico Veterinário Doutor em Biotecnologia.

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1 Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec Núcleo de Biotecnologia Marcelo Mendonça Médico Veterinário Doutor em Biotecnologia Pós-doutorando em Biotecnologia Produção de Anticorpos Monoclonais contra Listeria monocytogenes para Utilização em Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – Leite Belo Horizonte - 21/03/2013

2 Definição do Problema Listeria spp. – 8 espécies Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi L. marthii, L. rocourtiae (Graves et al., 2010; Leclercq et al., 2010) Características Causador da Listeriose L. monocytogenes – Humanos e Animais L. ivanovii – Animais, casos esporádicos em Humanos (Guillet et al., 2010) Bacilo Gram-positivo Anaeróbico facultativo Multiplicação (1°C a 45°C) Ubiquitário Todar, 2009

3 Presença de L. monocytogenes nos Alimentos Leite e seus derivados Produtos cárneos Vegetais e frutas (minimamente processados) Peixes e frutos do mar Orgãos de fiscalização - deteminam Zero Tolerance Prontos para consumo - Ready-to-eat (RTE) foods Definição do Problema 123 pessoas 25 mortes (CDC, 2011)

4 Metodologia convencional utilizada para detecção em alimentos LEB FRASER OXFORD PALCAM TSA-YE 30ºC / 24h 37ºC / 48h Fermentação de carboidratos Catalase Motilidade -hemólise Farber e Daley, 1995 Pré-enriquecimento enriquecimento 37ºC / 24 a 48h 37ºC / 24h 7 dias 24 – 48h 24h Método de Diagnóstico para L. monocytogenes 5 – 10 dias Mais dias! Definição do Problema

5 Métodos rápidos de diagnóstico de L. monocytogenes - Desejáveis Técnicas de Imunoensaios Alta sensibilidade, Especificidade e Reprodutíveis Anticorpos Monoclonais (MAbs) MAbs são imunoglobulinas secretadas por clones de células (hibridomas) que são obtidas através da fusão in vitro de linfócitos B produtores de anticorpos com células de mieloma (Linfócitos B tumorais) Solução do Problema e Diferencial

6 4 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria spp. MAb anti-proteína p30 - 3F8 Reconhece exclusivamente o gênero Listeria MAbs anti-InlA - 2D12, 3B7 e 4E4 Maior reatividade com Internalina A nativa 7 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria monocytogenes Após 6 Fusões Celulares – Listeria MAbs Estágio de desenvolvimento da tecnologia

7 ELISA indireto

8 Estágio de desenvolvimento da tecnologia Western blot MAb 2D12 anti-InlA de Listeria monocytogenes

9 1.L. monocytogenes F L. marthii 3.Staphylococcus aureus 4.Bacillus subtilis 5.Salmonella typhimurium 6.Bacillus thuringiensis 7.E. coli O157:H7 8.Lactococcus lactis 9.Enterococcus aerogenes 10. Lactobacillus paracasei 11. Klebsiella pneumoniae 12. Enterococcus faecalis Western blot Revelado com DAB MAb-3F8 anti-Listeria spp. – Proteína de 30 kDa (p30) Reação com L. monocytogenes e L. marthii Estágio de desenvolvimento da tecnologia 35 27

10 Separação Imunomagnética Immunomagnetic Separation (IMS) Separação e concentração do microrganismo alvo Ligação dos anticorpos em esferas magnetizadas Fonte: Bhunia, 2008 Estágio de desenvolvimento da tecnologia

11 MAb-2D12 (InlA) MAb-3F8 (p30 - gênero Listeria) Dynabeads anti-Listeria (Invitrogen) MAb-2D12 (InlA) 10 8 a 10 3 UFC/mL Diferença na captura entre anticorpos Eficiência de captura com diferentes [ ] em PBS

12 Separação Imunomagnética (IMS) Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Queijo de Cabra - artificialmente contaminado L. monocytogenes 4b L. innocua ~ 1 UFC/g 16 h a 37 o C 10 g de Alimento + 90 mL Caldo Fraser 10 mL IMS Contagem em Placa Estágio de desenvolvimento da tecnologia

13 Biossensor de Fibra Óptica Formato Sanduíche Captura e Detecção Fibras de poliestireno - 5 cm Sinal em tempo real Estágio de desenvolvimento da tecnologia

14 Imunoseparação Magnética seguido por Sensor de Fibra Óptica MAb-2D12 marcado Cy-5 InlA de L. monocytogenes Tempo Total da IMS + Fibra Óptica Aproximadamente 21 horas Queijo de Cabra - artificialmente contaminado Co-cultivo L.monocytogenes e L. innocua IMS seguido de ensaio com Fibra Óptica Estágio de desenvolvimento da tecnologia

15 Potencial de mercado

16 Diferenciais propostos em nossos estudos em comparação aos outros: Brasil gastou mais de 1 bilhão de reais entre 2008 e 2010 com importação de anticorpos monoclonais (Reis et al. 2011) A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada - UFPel demonstraram-se altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano Utilização de MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de identificação de L. monocytogenes pode ser reduzidos para 48h ou menos Desenvolvimento e implementação de plataformas de testes rápidos para detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos recombinantes previamente produzidos e caracterizados na UFPel Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar outras plataformas, que poderão ser empregadas no desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico para outras enfermidades importantes

17 Equipe de colaboradores – Listeria MAbs Primeira e Segunda Parte do Projeto – Produção dos anticorpos e plataformas Prof. José Antonio Guimarães Aleixo (Imunologia e Microbiologia de Alimentos) Prof. Wladimir Padilha da Silva (Microbiologia de Alimentos) Prof. Arun K. Bhunia - Purdue University/USA (Imunologia e Biologia Molecular) Prof. Fabricio Rochedo Conceição (Imunologia e Biologia Molecular) Profa. Ângela Nunes Moreira (Imunologia e Microbiologia de Alimentos) Segunda Parte do Projeto – Produção das plataformas Prof. Odir Antonio Dellagostin (Biologia Molecular e Bioinformática) Prof. Alan John Alexander McBride (Biologia Molecular e Proteômica) Mestrando Gustavo Schmidt Garcia Moreira (Imunologia e Bioinformática ) Doutoranda Karla Sequeira Mendonça (Microbiologia e Biologia Molecular)

18 Marcelo Mendonça (53) / Obrigado!

19 Slides Extras

20 Fusão Celular Estágio de desenvolvimento da tecnologia Extrato total proteínas de L. monocytogenes

21 Estágio de desenvolvimento da tecnologia Listeria monocytogenes expressando GFP MAb-2D12 anti-rInlA Mendonça et al – BMC Microbiology

22 Modified Oxford MAb- 2D12 BHI Plates Dynabeads MAb-3F8 MAb-2D12 Dynabeads IMS Queijo MAb-3F8 > 10 5 UFC.mL -1 Fibra Óptica – 10 3 UFC.mL

23 Imunoseparação Magnética Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Queijo de cabra artificialmente contaminado PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes L. monocytogenes + L. innocua

24 Revelado com DAB 2D12 - InlA F8 - p30 L.monocytogenes F4244 L. innocua F4248L. marthiiL. welshimeri 7.5% SDS-PAGE E. coli O157:H7 Dois MAbs juntos Identificação específica Gênero e espécie Western blot Estágio de desenvolvimento da tecnologia

25 Imunofluorescência MAb 2D12 Anti-InlA L. monocytogenes 4b (F4244) L. monocytogenes 4d (19117) L. innocua 6a Estágio de desenvolvimento da tecnologia

26 1/2a (V7) 1/2b (F4260) 1/2c (7644) 3a (19113) 3b (2540) 3c (2479) 4a (19114) 4b (F4244) 4c (19116) 4d (19117) 4ab (murray) 7 (1323) 4e (19118) SDS-PAGE 10% - Western blot PVDF MAb-3F8 anti-Listeria spp. Reação com todos os sorotipos de L. monocytogenes Revelado com DAB (3,3'-Diaminobenzidine) Estágio de desenvolvimento da tecnologia Western blot

27 Imunoseparação Magnética Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos Salsichas tipo hotdog artificialmente contaminado L. monocytogenes 4b e/ou L. innocua PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes 10 g de hotdog + 90 mL Fraser Plaqueado em agar BHI Após IMS

28

29 Após entrar no organismo e vencer a barreira intestinal Fígado Baço Cérebro Placenta Baixa morbidade - Alta mortalidade Taxa de mortalidade: 30% da população suscetível População de risco: Indivíduos imunocomprometidos Mulheres grávidas Idosos e crianças Adultos saudáveis (imunocompetentes) LISTERIOSE Septicemia, Meningite, Meningoencefalite Aborto Natimorto Nascimento criança doente


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