QBQ 0102 – Educação Física Carlos Hotta Tecnologia do DNA recombinante

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1 QBQ 0102 – Educação Física Carlos Hotta Tecnologia do DNA recombinante 18/06/13

2 A Tecnologia do DNA recombinante
A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos

3 1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de Salmonella

4 Polimerase Chain Reaction

5 Gel de agarose O DNA é negativo e é atraído pelo pólo positivo do aparato; A malha de agarose atrapalha a migração de moléculas maiores, que acabam migrando mais devagar no gel; O DNA é visualizado com marcadores fluorescentes e o tamanho produzido é estimado com a adição de marcadores com o tamanho conhecido.

6 Plasmídeos Plasmídeos são DNA circulares, muito menores que um cromossomos circular, que podem complementar as sequências do genoma da bactéria Plasmídeos são capazes de se auto-replicar e podem apresentar múltiplas cópias em uma só célula Plasmídeos geralmente possuem: origem de replicação, um local de múltiplos sítios de restrição, um gene de resistência a antibiótico

7 Enzimas de restrição cortam o DNA
Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em sequências específicas Geralmente reconhecem palíndromos no DNA Não nomeadas de acordo com seu organismo de origem -> Escherichia coli

8 Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou pontas cegas

9 Há centenas de enzimas de restrição diferentes

10 Ligação

11 Transformação Bactérias podem incorporar um plasmídeo por choque térmico ou eletroporação No choque térmico há a incorporação de DNA após um tratamento rápido a 37oC a 42oC. Na eletroporação, um pulso de alta voltagem faz com que a memebrana da bactéria permita a entrada dos plasmídeos.

12 Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?

13 A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA
A transcriptase reversa nos permite tornar o RNA novamente em DNA (cDNA) O cDNA é mais estável que o RNA e pode ser usado em reações de PCR Geralmente as sequências obtidas são de RNA maduro

14 Animais e plantas transgênicas
Transgênicos são organismos que tiveram seu genoma alterado utilizando-se a tecnologia do DNA recombinante A agricultura convencional vêm introduzindo genes novos nos organismos faz anos

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16 Como se gera animais transgênicos?

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18 A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferir sequências definidas para o genoma das plantas

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22 Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos

23 Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de replicação

24 Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores fluorescentes
Automatização permite sequenciar 96 sequências por vez, 8 a 12 vezes por dia 96 x 10 x 1000 = 960 mil pb por dia!

25 Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção de milhões de sequências simultâneas
Pode-se obter o mesmo número de sequências que no Projeto Genoma em questão de dias Existem diversas técnicas envolvidas que geram diversos tipos de sequências (de 50 pb a 10000pb) em diversas quantidades (de milhares a centenas de bilhões) Como analisar? A busca é a do genoma humano por U$1000 -> cada pessoa no planeta pode ter seu próprio genoma sequenciado! Por quê sequenciar?

26 O 454 é um (velho) sequenciador de nova geração

27 O pirosequenciamento mede a luminescência produzida quando um deoxinucleotídeo é incorporado

28 O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e sequenciar milhões de sequências em paralelo