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Replicação do DNA & Transposons
Enzimas e Mecanismos Envolvidos na Replicação e Transposição do DNA Prof. Henrique S. Costa, M.Sc.
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Mecanismos de Replicação
Início da replicação → pode ser ativada mais de uma vez em procariotos, mas somente uma vez em células eucarióticas (OriC). Movimento da forquilha de replicação → unidirecional (parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção) ou bidirecional (2 forquilhas deixam a origem em direções opostas). Direção da replicação → sempre no sentido 5’→ 3’. Semi-descontinuidade da replicação → a replicação ocorre de forma contínua numa das fitas do DNA e descontínua na outra.
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Mecanismos da Replicação
Início da Replicação Eucarioto Procarioto
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Mecanismos da Replicação
Movimento da Forquilha
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Mecanismos da Replicação
Direção da Replicação
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Mecanismos da Replicação
Semidescontinuidade da Replicação
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DNA Polimerases → enzimas que fazem a síntese de uma nova fita de DNA.
possuem a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de uma região pareada do DNA (crescimento da cadeia no sentido 5’→ 3’). DNA-polimerase I (pol I) → primeira polimerase caracterizada (1956) por Arthur Kornberg. Funções → 928 aminoácidos → 3 Domínios → Replicação → Reparo de erro → Remoção de P’
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DNA Polimerases NH2 COOH Atividade de Polimerase
Atividade de Exonuclease 3’ 5’ AA 324 517: Remove 1 nt Atividade de Exonuclease 5’ 3’ AA 1 324: Remove ~ 10 nt Atividade de Polimerase AA 521 928: Polimerizar NH2 COOH 1956: Arthur Kornberg
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DNA Polimerases → a atividade de exonuclease 3’→ 5’ apresenta-se extremamente importante para que o processo de replicação ocorra livre de erro. reconhecimento e clivagem de pareamentos errôneos na extremidade 3’OH da fita nascente (correção de erro), eliminando apenas o último nucleotídeo adicionado pela polimerase. → a atividade de exonuclease 5’→ 3’ remove blocos de nucleotídeos (10 nt) na ocorrência de quebras da ligação fosfodiéster (nick) ou falta de alguns nucleotídeos (gap).
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DNA Polimerase III Exonuclease 3’ 5’ Processividade Polimerização
Holoenzima → enzima composta por vários grupos polipeptídicos (20 ou +), fundamental no processo replicativo do cromossomo de E. coli. Exonuclease 3’ 5’ Processividade Polimerização Formação do dímero Síntese dos Fragmentos de Okazaki Estabilização
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DNA-Polimerase de Eucarioto
Polimerases Localização N M Função: Primase X Exo 3’ 5’ Replicação ? Reparo Processividade Baixa Alta Fidelidade
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Forquilha de Replicação
Durante o processo de replicação do DNA, 2 fatores devem ser considerados: → as fitas do DNA têm polaridades opostas → a DNA-polimerase sintetiza somente no sentido 5’ → 3’. # Dessa forma, uma das fitas pode ser sintetizada de forma contínua, enquanto a outra só pode ser sintetizada de forma descontínua. Fita contínua → 1 primer Fita descontínua → vários primers (fragmentos de Okazaki)
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Enzimas Envolvidas Na Replicação
Topoisomerases → promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo super-enrolamentos. A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras. Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas. Helicases → promovem a quebra das pontes de hidrogênio entre as bases, separando as 2 fitas de DNA. Essencial para que a forquilha de replicação possa se movimentar.
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Enzimas Envolvidas da Replicação
SSBs → proteínas que se ligam à fita simples do DNA. Evitam a formação de super-torções induzindo uma conformação do DNA ideal para a replicação e pareamento de bases (além de proteger a fita simples da degradação por nucleases). Primases → promovem a síntese de pequenas seqüências de RNA (primers). Para cada início de síntese de uma das fitas de DNA faz-se necessária a presença de um primer. Encontra-se, normalmente, associada à DNaB e outras proteínas (primossomo). Ligases → catalisam a formação das ligações fosfodiéster dos fragmentos de Okazaki.
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Enzimas da Replicação 1. Topoisomerases 2. Helicases 3. SSBs
4. Primase 5. DNA-Polimerase 6. DNA-Ligase
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Topoisomerase
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Helicase
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DNA-Polimerase
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Replicação: Visão Geral
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Término da Replicação PROCARIOTO
Em E. coli, podem existir 2 forquilhas de replicação que, durante o movimento bidirecional, encontram-se na região terminal Ter (180° a partir de oriC) T1 e T2 → regiões de terminação (específicas para a direção do movimento da forquilha). # Bidirecional – cada forquilha deve passar pela outra para finalizar a replicação. # Unidirecional – a forquilha deve retornar à origem de replicação. ■ genomas circulares → não oferecem problemas de replicação.
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Término da Replicação PROCARIOTO 180o T2 100pb T1
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Término da Replicação EUCARIOTO
Telômeros → regiões terminais dos cromossomos de eucariotos formadas por seqüências bastante conservadas e repetidas. # Telomerase – enzima responsável pela adição destas seqüências repetidas (RNA-polimerase) nos locais onde ocorreu a retirada dos primers. → reconhecimento e ligação ao telômero → adição de nucleotídeos conforme o molde de RNA da enzima ■ A perda de sua função leva à morte celular.
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Término da Replicação Genomas Lineares → Telômeros
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Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase
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Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase
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Transposons Década de 40: Barbara McClintock
Descoberta dos Elementos Genéticos Móveis em Milho “Elementos Controladores” 1983: Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina
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Transposons Elementos de Transposição Procariotos e Eucariotos
Fonte de variabilidade genética Ocorrem via DNA ou RNA Mutações: Gênicas ou Estruturais 2 a 20% do genoma dos seres vivos 700 a pb
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Transposons Alteração da Expressão Gênica Tn Excisão Inserção
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Transposons via DNA 1. IS: Seqüências de Inseção 2. Tn: Transposons
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Repetição Terminal Invertida Repetição Terminal Invertida
Transposons via DNA Transposon Simples IS1 Transposase Repetição Terminal Invertida Transposon Composto Tn1681 Enterotoxina IS1 Transposon Complexo Tn3 Transposase Resolvase Repetição Terminal Invertida amp
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Transposons via RNA Retrotransposons (similares a retrovírus)
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Mecanismos de Transposição
Clivagem não-alinhadas são efetuadas no sítio alvo O transposon é unido às extremidades de fitas simples As lacunas no sítio-alvo são preenchidas e seladas
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Mecanismos de Transposição
Replicativa Não-Replicativa Conservativa
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Considerações Finais A Replicação é a duplicação total do genoma.
Antecede as divisões celulares → Mitose e Meiose. Mitose → manutenção de células somáticas. Meiose → gera gametas (células germinativas). Máxima fidelidade → evitar alterações (Mutações).
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Considerações Finais Enzimas envolvidas → topoisomerase, helicase, SSB, primase, DNA-polimerase e DNA-ligase. Término da replicação → perda dos telômeros. Telômeros → senescência e câncer. Transposon → mecanismo de variabilidade.
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