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Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008.

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1 Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

2 Enzimas Atividade enzimática Produção industrial de enzimas O processo fermentativo; Separação de enzimas intra e extracelulares; Purificação; Controle de pureza; Produto final.

3 Atividade Enzimática As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas O que importa não é a massa, mas a atividade Proteínas desnaturadas Conserva a massa protéica Sem atividade catalítica

4 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou [P]) uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) Produto µmol/mL Tempo (min.) velocidade constante

5 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) Produto µmol/mL Tempo (min.) [ ] de substrato: -inativação parcial da enz., -inibição por produto. velocidade decresce

6 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) Produto µmol/mL Tempo (min.) velocidade constante [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível). velocidade decresce Para evitar a influência destes fatores associar- se: atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (Veloc. Constante)

7 Atividade Enzimática A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI). 1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por minuto em condições ótimas

8 Atividade Enzimática Métodos para a determinação da atividade de enzimas: Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo. Métodos para avaliar as [ ] das espécies: Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria... Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

9 Atividade Enzimática A medida da atividade enzimática é imprescindível para monitorar a purificação de uma enzima. A atividade específica: número de Unidades de enzima miligramas de proteína Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.

10 Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml Caldo contendo a enzima

11 Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido – 1 h Caldo contendo a enzima

12 Produção Industrial de Enzimas Fonte Animais Vegetais Microrganismos Lípase Pancreática, Pepsina Bromelina, Papaína Lactase: S.fragilis, Lipase: A.niger

13 Produção Industrial de Enzimas A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida. Interessante para países que dispõem de resíduos agroindustriais - baixo custo

14 Produção Industrial de Enzimas Processo importantes prévios à fermentação preparo do inóculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal. Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro.

15 Produção Industrial de Enzimas Linhagem microbiana Composição dos meios de cultivo Sigilosamente protegida Quimicamente conhecidos (sintéticos) Matérias-primas naturais Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento

16 Produção Industrial de Enzimas Fermentadores Mecanicamente agitados; a litros; Operados de modo descontínuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração; Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma); As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.

17 Produção Industrial de Enzimas Processo a jusante (downstream) da fermentação As operações que se seguem ao processo fermentativo Dependem da localização da enzima de interesse IntracelularExtracelular

18 Extração – Enzimas Extracelulares O caldo é resfriado a cerca de 5°C, o Estabilidade do produto e o Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes. O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima. A separação das células Centrifugação Filtração

19 Extração – Enzimas Extracelulares Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

20 Extração – Enzimas Extracelulares Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C) Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade enzimática pode ser embalada para comercialização.

21 Extração – Enzimas Intracelulares Centrifugação Romper as Células Caldo de Cultivo Biomassa

22 Extração – Enzimas Intracelulares Romper as Células Moagem com Esferas de Vidro Homogeneização em Alta Pressão Sonificação Tratamentos Químicos Tratamentos Enzimáticos

23 Extração – Enzimas Intracelulares A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso Ácidos NucléicosPrecipitação Mn II Filtração Sobrenadante Concentrado Ultrafiltração Concentração à vácuo

24 Purificação Concentrado Enzimático Processo Iguais Forma de apresentação e pureza

25 Purificação Concentrado Enzimático Processo Iguais Forma de apresentação e pureza diluída pode ser um produto comercializável Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying)

26 Purificação Concentrado Enzimático Processo Iguais Forma de apresentação e pureza diluída pode ser um produto comercializável Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying) Padronização da atividade com material sólido inerte Peletizacao ou aglomeração

27 Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. Concentrado Enzimático Precipitação (NH 4 ) 2 SO 4 Centrifugação Moléculas Proteicas

28 Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. Concentrado Enzimático Precipitação (NH 4 ) 2 SO 4 Centrifugação Moléculas Proteicas solventes (etanol, metanol)

29 Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. Concentrado Enzimático Precipitação (NH 4 ) 2 SO 4 Centrifugação Moléculas Proteicas solventes (etanol, metanol) ultrafiltração, microfiltração e osmose inversa

30 Purificação Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, técnicas cromatográficas são empregadas Cromatografia de Troca Iônica Carga das Moléculas Cromatografia de partição ou de filtração em gel Tamanho da Moléculas Cromatografia de Afinidade Ligação bio-específica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores)

31 Purificação A concentração pode ser obtida das seguintes formas : Adição de um polímero tipo Sephadex G-25 Ultrafiltração Purificação por Cromatografia Remoção de água sob vácuo Concentração Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H 2 O Remoção do solvente por membrana semi-permeável Liofilização

32 Purificação Controle de Pureza: Eletroforese. o Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial o As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável, o é tão sensível que se podem detectar proteínas que só diferem em um aa.

33 Purificação O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis: Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial; Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.

34 Purificação

35 Produção Industrial de Enzimas Caldo Fermentado Enzima Extracelular Enzima Intracelular Separação sólido/líquido Concentração Separação sólido/líquido Rompimento Celular Precipitação Ác. Nucléicos Purificação Concentração

36 Produção Industrial de Enzimas Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas: - São produzidas de fontes renováveis. - São completamente degradáveis. - Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).


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