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Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Centro de Ciências Biológicas Programa de Bolsas REUNI Florianópolis, 23.

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1 Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Centro de Ciências Biológicas Programa de Bolsas REUNI Florianópolis, 23 de novembro de 2010 Proteômica

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3 Proteômica A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.

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5 Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico. Tempo Espaço Núcleo Citoplasma Membrana Proteômica

6 Proteômica sistemática: mapa protéico Tecidos Células Compartimentos celulares Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência Desenvolvimento Interações entre microorganismos e hospedeiros Tratamentos Proteômica

7 Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer

8 1999 Proteoma do cérebro de camundongo 2006 Proteoma do hipocampo de camundongo 2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos 2005 Proteoma do cérebro de rato 2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício 2004 Proteoma de hipocampo humano 2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano 2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo

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10 Revistas

11 Etapas metodológicas

12 Tratamento do animal Extração das proteínas Espectrometria de massa Digestão in gel Focalização isoelétrica Principais etapas metodológicas Eletroforese em gel 2-DE

13 Isolamento de proteinas

14 Extração da amostra Tampão de lise: 25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS 0,5 M NaCl 5% glicerol (v/v) 1 mM PMSF Lise mecânica da célula Centrifugação 30 min a x g a 4º C Proteínas nucleares Proteínas citoplasmáticas Proteínas membranares Precipitado é re-extraído SN1+ SN2 Homogenato de ptns em gelo por 20 min Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento. Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para evitar perda protéica.

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17 Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit Solução com Íon cúprico (Cu +1 ) Cu +1 Agente colorimétrico Cu nm Proteínas totais MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA.

18 Limpeza da amostra com Clean up Kit 100 ug /ul de proteína Solução precipitante Centrifugação Baseada na precipitação por TCA Diversas moléculas são eliminadas: -DNA, lipídeos - Sais, detergentes Pellet de Proteína pura Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação: 7 M Uréia 2 M Tiuréia 2%(p/v) CHAPS 0.5% de IPG buffer pH mM DTT 0,001% azul de bromofeno MÉTODOS BCA:

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20 Agentes redutores: DTT Solubilização da amostra Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS

21 Hidratação do strip Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10

22 Strips foram removidos Cerâmica IEFStrips foram posicionados Paper Pads umedecidos Total: V/h e 25 uA/strip Ettan IPGphor 3Ajuste dos eletrodos Focalicalização isoelétrica (IEF)

23 Separação das proteínas por pI Gel poliacrilamida 12,5% Cuba vertical Hoefer SE Ruby Separação das ptns por massa Proteínas separadas por pI e massa 1º DTT 2º Iodoacetamida Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora Eletroforese em gel bidimensional (2D)

24 Análise simultânea de diversas proteínas. Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes. Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D

25 Análise das imagens no gel Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais) Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots

26 Digestão in gel Descoloração: 25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila Tripsinização (entre os resíduos de lisina e arginina) Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético Peptídeos são secos à vácuo Estocagem a -20ºC Excisão dos spots

27 Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós- traducionais das proteínas. Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa Amostras 2- DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector Sistema à vácuo

28 Peptídios são ionizados Os íons são dessorvidos Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4- hidroxicinâmico Espectômetro de Massa

29 Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética Colisão dos íons ao detector Espectômetro de Massa As massas dos fragmentos são separadas e detectadas As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo

30 Espectômetro de Massa Identificação de cada proteína do mapa proteômico

31 Proteômica

32 Array-based protein interaction detection

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34 Protein microarrays

35 Proteomicworld.com


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