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BIOQUÍMICA DE DNA E CROMOSSOMOS Estabelecimento da Eficiência de Transcrição durante as Fases S precoce e tardia.

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1 BIOQUÍMICA DE DNA E CROMOSSOMOS Estabelecimento da Eficiência de Transcrição durante as Fases S precoce e tardia

2 O objetivo do trabalho é determinar em qual período da fase S ocorre maior eficiência de transcrição. INTRODUÇÃO O CICLO CELULAR Em células animais, a replicação do DNA ocorre de maneira programada num determinado tempo fixo na fase S.

3 A Mitose e a divisão celular ocorrem durante a fase M, que é relativamente curta. Essa é seguida pela fase G1, que cobre a parte mais longa do ciclo celular. Após G1, ocorre a fase S,a qual ocorre a síntese do DNA. Durante a fase G2, a célula prepara-se para a mitose e então entra na fase M novamente.

4 MÉTODOS: Foram usadas células de rato injetadas com genes repórteres de plasmídeos S16-LacZ e Miogenina-LacZ com marcador GFP. Para determinar em qual período da fase S houve maior atividade de transcrição foram injetados gene em tempos diferentes da fase S.

5 FASE S PRECOCEFASE S TARDIA S16-LacZ Miogenina-LacZ S16-LacZ Miogenina-LacZ

6 A injeção na fase S Tardia retêm uma baixa taxa de transcrição, ao contrário da fase S Precoce, mantendo um alto nível de expressão.

7 Para finalizar a idéia de que o tempo de injeção determina uma melhor transcrição, foi projetada uma experiência para medir a transcrição na fase S tardia e precoce em uma única célula. S16-LacZ EF1-GFP FASE S PRECOCEFASE S TARDIA S16-LacZ EF1-GFP

8 Enquanto a célula injetada com S16-LacZ na fase precoce expressão 63% de atividade; só 19% desta mesma população expressão o plasmídeo de EF1-GFP injetados na fase tardia.

9 Foram obtidos resultados semelhantes quando trocaram a ordem de injeção dos plasmídeos. Estes resultados mostram claramente que o DNA na fase S tardia é relativamente inativo; ao passo que na fase S precoce é altamente transcrito.

10 Para avaliar diretamente a atividade de transcrição na S precoce, foi usado o RT-PCR ( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Transcriptase Reversa é um RNA-dependente DNA polimerase que catalisa a polimerização de nucleotídeos usando templades de DNA, RNA ou híbridos RNA:DNA. O Sistema está destinado para síntese do DNA complementar (cDNA) a partir do RNA com AMV Reverse Transcriptase e amplificação do DNA a DNA de dupla hélice com tfl DNA polimerase. Ambas as reações ocorrem num tampão específico em um único tubo.

11 Mais uma vez fica evidente; com a amplificação do RNA e DNA que a atividade de transcrição é maior na fase S precoce.

12 Utilizando a análise de PCR quantitativa, a estrutura da cromatina foi analisada, caracterizando acetilação da histona. O DNA injetado na fase precoce era mais enriquecido de histonas acetiladas do que o DNA na fase tardia. A acetilação das histonas afrouxa a interação entre o DNA e estas proteínas, favorecendo a transcrição gênica; a desacetilação das histonas está associada ao bloqueio da transcrição de alguns genes.

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