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4 BIOQUÍMICA DE “ DNA E CROMOSSOMOS ”
Estabelecimento da Eficiência de Transcrição durante as Fases S precoce e tardia

5 INTRODUÇÃO O objetivo do trabalho é determinar em qual período da fase S ocorre maior eficiência de transcrição. O CICLO CELULAR Em células animais, a replicação do DNA ocorre de maneira programada num determinado tempo fixo na fase S.

6 A Mitose e a divisão celular ocorrem durante a fase M, que é relativamente curta.
Essa é seguida pela fase G1, que cobre a parte mais longa do ciclo celular. Após G1, ocorre a fase S,a qual ocorre a síntese do DNA. Durante a fase G2, a célula prepara-se para a mitose e então entra na fase M novamente.

7 MÉTODOS: Foram usadas células de rato injetadas com genes repórteres de plasmídeos S16-LacZ e Miogenina-LacZ com marcador GFP. Para determinar em qual período da fase S houve maior atividade de transcrição foram injetados gene em tempos diferentes da fase S.

8 FASE S PRECOCE FASE S TARDIA S16-LacZ S16-LacZ Miogenina-LacZ

9 A injeção na fase S Tardia retêm uma baixa taxa de transcrição, ao contrário da fase S Precoce, mantendo um alto nível de expressão.

10 Para finalizar a idéia de que o tempo de injeção determina uma melhor transcrição, foi projetada uma experiência para medir a transcrição na fase S tardia e precoce em uma única célula. FASE S PRECOCE FASE S TARDIA S16-LacZ S16-LacZ EF1-GFP EF1-GFP

11 Enquanto a célula injetada com S16-LacZ na fase precoce expressão 63% de atividade; só 19% desta mesma população expressão o plasmídeo de EF1-GFP injetados na fase tardia.

12 Foram obtidos resultados semelhantes quando trocaram a ordem de injeção dos plasmídeos.
Estes resultados mostram claramente que o DNA na fase S tardia é relativamente inativo; ao passo que na fase S precoce é altamente transcrito.

13 Para avaliar diretamente a atividade de transcrição na S precoce, foi usado o RT-PCR ( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Transcriptase Reversa é um RNA-dependente DNA polimerase que catalisa a polimerização de nucleotídeos usando templades de DNA, RNA ou híbridos RNA:DNA. O Sistema está destinado para síntese do DNA complementar (cDNA) a partir do RNA com AMV Reverse Transcriptase e amplificação do DNA a DNA de dupla hélice com tfl DNA polimerase. Ambas as reações ocorrem num tampão específico em um único tubo.

14 Mais uma vez fica evidente; com a amplificação do RNA e DNA que a atividade de transcrição é maior na fase S precoce.

15 Utilizando a análise de PCR quantitativa, a estrutura da cromatina foi analisada, caracterizando acetilação da histona. O DNA injetado na fase precoce era mais enriquecido de histonas acetiladas do que o DNA na fase tardia. A acetilação das histonas afrouxa a interação entre o DNA e estas proteínas, favorecendo a transcrição gênica; a desacetilação das histonas está associada ao bloqueio da transcrição de alguns genes.

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