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PublicouValentina Rosal Alterado mais de 10 anos atrás
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Genómica Licenciatura em Ciências Biomédicas Departamento de Ciências da Saúde, UCP Fevereiro 2013
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Sumário 3. Montagem de genomas Montagem hierárquica Montagem de genomas completos Montagem de genomas com base em modelos Problemas associados à montagem dos genomas – Controlo de qualidade 18-03-2013Genómica 12-13 MJC2
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Aumenta o número de peças para 2-3 triliões. Sobreposições em média de duas centenas de pares de bases. Equivale a ter um puzzle de 30 milhões de peças Montagem de genomas Após a sequenciação temos fragmentos (de tamanhos que vão de 1000 a 40 pbs) que é preciso reordenar na sequência original. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC3
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Algumas das peças… Faltam – Problemas na construção das bibliotecas – Problemas com a amplificação por PCR Têm erros – Zonas repetitivas – Erros no PCR 18-03-2013Genómica 12-13 MJC4 Aumentamos o nº de vezes que cada peça é sequenciada! Entre 8 e 100 vezes
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A sequência (read) ideal É longa Não tem erros 18-03-2013Genómica 12-13 MJC5
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Podemos considerar 2 tipos Única (single read) – Resulta da sequenciação do fragmento em si. Emparelhada (paired read) – Nestas leituras eu sei a sequência das pontas e a que distância estão uma da outra. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC6
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MONTAGEM HIERÁRQUICA OU DE CLONES 18-03-2013Genómica 12-13 MJC7
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Abordagem usada para alinhar grandes inserções clonadas – Primeiro é feito o mapeamento dos clones por padrões de digestão, marcadores de linkage ou mutações induzidas. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC8
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Desse mapeamento…. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC9 Escolhem-se os fragmentos a vermelho pois implicam a menor sobreposição. É feita a sequenciação desses fragmentos: – Cada sequenciação (read) é avaliada quanto à sua qualidade. – É reconstruida a sequencia inicial usando as sobreposições.
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MONTAGEM DE GENOMAS COMPLETOS 18-03-2013Genómica 12-13 MJC10
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Método mais aplicado atualmente Uma vez que a maioria da sequenciação já não implica clonagem. Dispensa o passo do mapeamento. São sequenciadas as extremidades dos vários fragmentos que são depois alinhadas. Genómica 12-13 MJC 18-03-201311
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Desse alinhamento surge o contig 18-03-2013 Genómica 12-13 MJC 12 Inclui 3 fases: – Sobreposição – Alinhamento – Consenso
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Desse alinhamento surge o contig 18-03-2013 Genómica 12-13 MJC 13 A localização vai ser determinada pela homologia
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Vários contigs dão um scaffold 18-03-2013 Genómica 12-13 MJC 14
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ALGUNS ALGORITMOS DE MONTAGEM DE GENOMAS 18-03-2013Genómica 12-13 MJC16
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Greedy Como a homologia é a única condição este tipo de algoritmos é muito influenciado pelas sequências repetitivas ou homologias. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC17
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Overlap-Layout-Consensus Todas as sobreposições são mapeadas (Overlap) É eliminada a informação redundante (Layout) Usando a teoria de grafos é desenhado o mapa mais simples e que corresponderá à organização inicial. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC18
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Overlap-Layout-Consensus Pode ser substituído pelo: Align-Layout-Consensus pois já há vários genomas de referência sequenciados. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC19
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CONTROLO DE QUALIDADE 18-03-2013Genómica 12-13 MJC20
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Em genomas de novo Não se sabe quase nada – Nº de scaffolds e contigs que representam o genoma. – A proporção de reads que consegue ser – O comprimento dos contigs e scaffolds relativamente ao comprimento do genoma. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC21
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N50 Tamanho do contig mais curto acima do qual se inclui 50% do genoma. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC22
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Os vários algoritmos devem ser comparados Foi feita uma comparação no artigo GAGE: 18-03-2013Genómica 12-13 MJC23
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O algoritmo deve ter em conta Dependendo do organismo – Tamanho diferente dos genomas – Heterozigotia diferente Humanos (1 par de bases pair/1000) Lesmas do mar 1/50–100 18-03-2013Genómica 12-13 MJC24
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Independentemente do algoritmo… Entra lixo Sai lixo – Muitos sequenciadores têm controlos de qualidade para contaminações, quimeras e erros de leitura. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC25
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MONTAGEM COMPARATIVA 18-03-2013Genómica 12-13 MJC26
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Genomas de referência Genomas de mesma espécie ou espécies semelhantes que servem de modelo. Os algoritmos tentam alinhar as sequências obtidas ao que já está sequenciado 18-03-2013Genómica 12-13 MJC27
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PROBLEMAS NA MONTAGEM DE GENOMAS 18-03-2013Genómica 12-13 MJC28
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Dificuldades Contaminação – Sequências que não pertencem ao genoma que se quer sequenciar. Erros de montagem – As sequências repetidas podem induzir os algoritmos de montagem em erro. As secções podem ser montadas como mais curtas ou sobrepostas pelo que desaparecem do genoma final. Homologia em grande escala. – Nos genomas dos mamíferos há zonas com uma grande percentagem de homologia (>90%) mas que são zonas diferentes do genoma. Como a homologia éusada para fazer os alinhamentos as montagens ficammal feitas. Polimorfismo genómico – Dado que muitos genomas são poliploides a montagem de genomas muitas vezes não consegue distinguir estes polimorfismos como possibilidades alternativas do mesmo locus. 18-03-2013Genómica 12-13 MJC29
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Efeito das zonas repetidas 18-03-2013Genómica 12-13 MJC30
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Bibliografia http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genom e/assembly/assembly.shtml http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genom e/assembly/assembly.shtml http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly _primer.shtml http://www.cbcb.umd.edu/research/assembly _primer.shtml Artigo: de novo genome assembly; GAGE ambos na pasta 18-03-2013Genómica 12-13 MJC32
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