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UBA III – Biologia Molecular Aula prática 2 2012/2013 Maria José Correia

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Apresentação em tema: "UBA III – Biologia Molecular Aula prática 2 2012/2013 Maria José Correia"— Transcrição da apresentação:

1 UBA III – Biologia Molecular Aula prática /2013 Maria José Correia

2 11/10/2013 Aplicações biotecnológicas das enzimas de restrição Eletroforese em gel de agarose Avaliação do padrão de restrição obtido pela digestão de DNA λ com as enzimas PstI, EcoRI e HindIII. Sumário P2:

3 11/10/2013 Tecnologia do DNA recombinante/ clonagem de genes Farmacologia Biotecnologia em processos industriais Fingerprinting de DNA Testes de paternidade Investigações criminais e outras aplicações forenses Manipulação de produtos transgénicos Incremento valor comercial de espécies Terapia génica transferência direta de genes em humanos com fim terapêutico Enzimas de restrição – ferramentas básicas em biologia molecular

4 11/10/ Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo elétrico Fatores que influenciam a migração de DNA em gel Peso molecular Conformação do DNA Concentração de agarose Voltagem aplicada Composição do tampão de eletroforese Eletroforese em gel de agarose

5 11/10/ Eletroforese: preparação do gel de agarose 1. Preparar uma solução de agarose em tampão TAE (1x) com concentração final de 1% (m/v). 2. Aquecer a mistura em microondas até toda a agarose se ter dissolvido. 3. Montar o suporte do gel na respetiva base de preparação do gel. 4. Colocar o pente formador de poços na posição correta. 5. Verter a agarose no suporte eliminando bolhas de ar que se tenham formado e deixar solidificar à temperatura ambiente. 6. Retirar o pente cuidadosamente para não danificar os poços. 7. Colocar o suporte na tina de eletroforese, de modo a que os poços estejam do lado do elétrodo negativo, e adicionar tampão TAE(1x)

6 11/10/ Electroforese: preparação das amostras 1. Adicionar tampão de carga às reações de digestão (L, P, E e N) este vai conferir densidade à amostra, facilitando a sua aplicação nos poços 2. Aplicar as amostras nos respetivos poços com uma micropipeta, evitando a contaminação dos poços adjacentes. 3. Reservar um dos poços para aplicar marcador de pesos moleculares (para referência) 4. Colocar a tampa na tina e verificar se a migração das amostras se dá no sentido cátodo-ânodo (preto-vermelho). 5. Estabelecer a corrida a 100V durante 30 minutos. 6. Depois da corrida, desligar a tina e retirar o gel e colocá-lo numa tina com corante. 7. Lavar o gel com água (40-55ºC) 8. Examinar os resultados.

7 11/10/ Registo e análise dos resultados DNA λ Pst I EcoRI Hind III x y x y Medir a distância poço – banda registar valores na tabela


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