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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

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Apresentação em tema: "Faculdade de Medicina da Universidade do Porto"— Transcrição da apresentação:

1 Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Laboratório de Biologia Celular e Molecular Estudo da caspase-3 e da dismútase do superóxido no córtex supra-renal após administração crónica de ACTH Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais: efeito de 3 dosagens de ACTH na secreção de corticosterona Fátima Leal Seabra (Orientador: Prof. Doutor Henrique Almeida)

2 Objectivos do estudo Objectivos gerais: Objectivo específico:
Aplicação de técnicas laboratoriais leccionadas durante as aulas de Biologia Celular e Molecular Dar a conhecer a vivência laboratorial Estimular a curiosidade no domínio da investigação Objectivo específico: Pesquisa da expressão de MnSOD e do factor apoptótico caspase-3, por imunocitoquímica, em animais tratados com ACTH Objectivo específico (antes deste) era a administração continuada de ACTH, em 3 concentrações diferentes, ministrada por meio de bombas osmóticas colocadas intraperitonealmente

3 Razões Pesquisa de MnSOD: Colateralmente,
Verificou-se que a administração aguda de ACTH aumenta a sua expressão, mas desconhece-se o efeito da administração crónica Colateralmente, Tendo-se observado que a supressão de ACTH aumenta a expressão de caspase-3, indagou-se se a sua administração crónica a diminui.

4 Introdução-Índice A Glândula supra-renal
Radicais livres e dismútase do superóxido A caspase-3

5 A glândula supra-renal (GSR)
cai.md.chula.ac.th Ultra-estrutura das células do Córtex de GSR

6 A hormona adrenocorticotrófica
A hormona adrenocorticotrófica (ACTH) é o maior estimulante da secreção das hormonas adrenocorticais, nomeadamente dos glicocorticóides (corticosterona e cortisol)

7 A glândula supra-renal (GSR)

8 Fontes e consequências dos radicais livres
Fontes endógenas: Cadeia respiratória Reacções enzímicas Reacções de autooxidação Fontes exógenas: Fumo do tabaco Poluentes Luz UV Radiações ionizantes Xenobióticos Produção de radicais livres Metais de transição Como se verifica o ACTH, actua nas várias regiões da GSR. Como esta é muito rica em mitocôndrias e sendo estas fonte de produção de de radicais livres, dado às elevadas quantidades de oxigénio presente nestas. Peroxidação lipídica Alterações proteicas Modificações nas bases de DNA Lesão dos tecidos Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: (adaptação)

9 Defesas dos antioxidantes
Produção de radicais livres Enzimas antioxidantes: dismútase do superóxido catálase peroxídase da glutationa Proteínas que se ligam aos metais: transferrina ferritina lactoferrina Metais de transição Outras substâncias: fases lipídicas: tocoferóis ubiquitinol carotenóides flavonóides fases aquosas ascorbato urato glutationa Lesão dos tecidos Mecanismos de reparação Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: (adaptação)

10 A dismútase do superóxido, SOD
Há 3 isoformas: Intracelulares SOD cobre-zinco (CuZnSOD) Massa molecular de 32 kDa Homodímero Encontrada em organelos e no citoplasma SOD manganésio (MnSOD) Massa molecular de 40 kDa Homotetrâmero Presente em mitocôndrias, nomeadamente de GSR Distingue-se da CuZnSOD pois não é inibida com cianeto Homodímero ou tetrâmero – subunidades todas iguais Dímero – 2 subunidades proteicas Tetrâmero – 4 subunidades proteicas

11 A dismútase do superóxido, SOD
Extracelular SOD extracelular (EC-SOD) Massa molecular de 135kDa Tetrâmero Contém um átomo de Zn e Cu em cada subunidade Sintetizada em alguns tipos de células: - células endoteliais - fibroblastos

12 A caspase-3 Membro de uma família de proteases, com resíduos de cisteína (C) no seu local catalítico e que clivam proteínas-substrato no extremo carboxílico de resíduos de ácido aspártico (Asp). “executora” da morte celular programada - apoptose

13 A caspase-3 Lesões nas mitocôndrias
Libertação do citocromo c e de moléculas pró-apoptóticas (Smac/Diablo) Citocromo c induz a formação do apoptossoma (Apaf-1 e Caspase-9) Activação de uma via de caspases pela caspase-9 Activação da caspase-3 Nota: Smac/ Diablo promovem a apoptose interferindo com a acção dos IAPs que são inibidores das caspases The Cell A Molecular Approach,Third Edition, Geoffrey M Cooper et al

14 A caspase-3 Célula Normal Célula apoptótica
medidacte.timone.univ-mrs.fr/.../ apoptose.html Molecular Cell Biology, Fourth edition, Lodish et al

15 Métodos - Índice Introdução de bombas osmóticas
Colheita e processamento de glândulas supra-renais: Microscopia de luz (imunocitoquímica) Microscopia electrónica

16 Introdução de Bombas Osmóticas
Ratos machos Wistar 3 meses de idade Peso ~262g Bombas osmóticas Alzet®, com Soro fisiológico (SF) ACTH com concentração de 1mg/1mL

17 Introdução de Bombas Osmóticas
Anestesia com Sevorane® a 5% em mistura oxigénio:ar de 1:2 Laparotomia mediana inferior Introdução das bombas na cavidade peritoneal Sutura da parede abdominal Aplicação de Bombas Osmóticas intraperitoniais: Estudo do efeito de endotoxina na microestrutura da glândula supra-renal do rato, Michel Sapateiro Luís, 2003

18 Recolha das supra-renais e preparação para microscopia
Ao fim de 7 dias sacrificaram-se os animais por decapitação Microscopia óptica Fixaram-se porções de glândula supra-renal em formol Incluíram-se em parafina Fizeram-se cortes com micrótomo e colocaram-se estes em lâminas com poli-L-lisina Microscopia electrónica Fixaram-se porções de glândula supra-renal com glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato Inclusão em EPON Fizeram-se cortes ultrafinos que se colocaram em grelhas e se coraram para observar no microscópio electrónico

19 Imunocitoquímica da MnSOD
Desparafinação dos cortes Hidratação Bloqueio da peroxídase endógena com a 3% Bloqueio com BSA 2% em TBS Incubação com Anti-MnSOD (anticorpo I de coelho) durante 24h Incubação com anticorpo II, anti-coelho biotinilado durante 30 min Adicionou-se o complexo ABC (Streptavidina Peroxídase) Revelação com DAB Contraste com Hematoxilina + Eosina Mantagem com Entellan Observação a microscopia de luz

20 Imunocitoquímica da Caspase-3
Desparafinação Hidratação Colocar os cortes em tampão de citrato até entrar em ebulição Baixar a temperatura Inibição da peroxídase endógena por adição a 3% Bloqueou-se com BSA 5% em TBS-T Adicionou-se anticorpo I de coelho durante 24h Incubação 30 min com anticorpo II, anti-coelho, biotinilado Incubação com complexo ABC Revelação com DAB Contraste com hematoxilina e eosina Montagem com Entellan Observação a microscopia de luz

21 Resultados -Índice Microscopia electrónica Microscopia óptica
Cortes semi-finos Imunocitoquímica da SOD Imunocitoquímica da caspase-3

22 Microscopia óptica Cortes semi-finos
ZG da GSR no animal controlo ZG na GSR no animal tratado com ACTH

23 Resultados Microscopia electrónica
mitocôndrias Inclusões lipídicas nucléolo REL GSR em que foi administrado soro fisiológico (SF) no animal heterocromatina GSR em que foi administrado ACTH no animal

24 Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSOD
Cápsula ZG ZF córtex ZR medula GSR do animal em que houve administração de ACTH

25 Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSOD
ZF da GSR no controlo (SF) ZF da GSR no animal tratado com ACTH

26 Microscopia óptica Imunocitoquímica da caspase-3
cápsula ZG ZF da GSR no animal em o ACTH foi administrado ZF Cápsula, ZG e ZF da GSR no animal controlo (SF)

27 Conclusões A introdução de bombas osmóticas é tecnicamente fácil
É necessário aumentar o número de animais para confirmar os dados observados; A administração de ACTH não altera a localização da expressão de MnSOD relativamente ao controlo e em ambos os casos há uma intensidade de marcação importante; A marcação da caspase-3 ocorreu em núcleos e citoplasma da ZF/ZR após administração crónica de ACTH. É possível que tal resulte de: Activação de processos apoptóticos, ainda sem expressão morfológica; Activação de uma via de sinalização não associada a morte celular, em que a caspase-3 parece estar também envolvida

28 Bibliografia [1] R.E. Kramer, W.E. Rainey; B, Funkenstein, A. Doee; E. R. Simpson, M.R. Waterman, Induction of syntisis of mitochondrial steroidogenic enzymes of bovine adrenocortical cells by analogs of cyclic AMP, J. Biol. Chem, 259 (1984) [2] S. Standring, H. Ellis; J. C. Healy, D. Jahnson, A. Williams, Gray’s Anatomy The Basis of Clinical Practice 39th Edition, Elsevier Churcill Livingstone, 2005 [3] D.M. Stocco, Tracking the role of a star in sky of a new millennium, Mol. Endocrinol. 15 (2001) [4] L.K. Christenson, J.F. Strauss III, Steroidogenic acute regulatory protein: an update on its regulation and mechanism of action. Arch Med. Res. 32 (2001) [5] H. Takemori, J. Doi, N. Horike, Y. Katoh, L. Min, X. Lin, Z. Wang, M. Muraoka, M. Okamoto, Salt-inducible kinase–mediated regulation of steroidogenisis at the early stage of ACTH-stimulation, J. Steroid Biochem and Mol. Biol. 85 (2003) [6] P. Val, C. Aiguesperse, B. Ragazzon, G. Veyssière, A. LeFrançois-Martinez, A. Martinez, Adrencorticotropin/3’,5’-Ciclic AMP-Mediated Transcription of the Scavenger akr1-b7 Gene in Adrenocortical Cells Is Dependent on three Functionaly Distinct Steroidogenic Factor -1ic Factor -1-Responsive Elements, Endocrinol. (2004), 145(2): [7] I. S. Young, J. V. Woodside, Antioxidants in health and disease, J Clin Pathol,54 (2001) [8] G.R. Buettner, The Pecking Order of Free Radicals and Antioxidants: Lipid Peroxidation, a-Tocopherol, and Ascorbate, Arch Biochem and Biophys, 2 (1993) [9] M.E. Rosenfeld, Inflammation, lipids, and free radicals: lessons learned from the atherogenic process, Semin Reprod Endocrinol, 16 (1998) [10] B. Halliwell, Vitamina C and Genomic stability, Mutation Research, 475 (2001) 29-35 [11] O. Arrigoni, M.C. Tullio, Ascorbic acid: much more than just an antioxidant, Biochim et Biophis Acta, 1569 (2002) 1-9 [12] R.C. Rose, A.M. Bode, Biology of free radical scavengers: an evaluation of ascorbate, The FASEB Journal, 7 (Sep 1993) [13] A. Meister, Glutathione-Ascorbic Acid Antioxidant System in Animals, The journal of Biological Chemistry, 269:13 (1994) [14] R.A. Weisiger, I. Fridovich, Mitochondrial superoxide dismutase of site of synthesis in intramitochondrial location, J. Biol Chem 248 (1973) [15] S.L. Marklund, E. Holme, L. Hellner, Superoxide dismutase in extracelular fluids, Clin. Chim. Acta, 126 (1982) 41-51 [16] G. M. Cooper, R. E. Hausman, The Cell a Molecular Approach, Sinauer, Third Edition [17] H. Lodish, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. E. Darnell, Molecular Cell Biology, 4th Edition

29 Agradecimentos Prof. Doutor Henrique Almeida
Drªs Liliana Matos e Adriana Rodrigues D. Maria Amélia Ferreira e D. Elisa Galvão

30 Fim


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