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Estudo da caspase-3 e da dismútase do superóxido no córtex supra-renal após administração crónica de ACTH Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais:

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1 Estudo da caspase-3 e da dismútase do superóxido no córtex supra-renal após administração crónica de ACTH Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais: efeito de 3 dosagens de ACTH na secreção de corticosterona Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Laboratório de Biologia Celular e Molecular Fátima Leal Seabra (Orientador: Prof. Doutor Henrique Almeida)

2 Objectivos do estudo Objectivos gerais: Aplicação de técnicas laboratoriais leccionadas durante as aulas de Biologia Celular e Molecular Dar a conhecer a vivência laboratorial Estimular a curiosidade no domínio da investigação Objectivo específico: Pesquisa da expressão de MnSOD e do factor apoptótico caspase-3, por imunocitoquímica, em animais tratados com ACTH

3 Razões Pesquisa de MnSOD: Verificou-se que a administração aguda de ACTH aumenta a sua expressão, mas desconhece-se o efeito da administração crónica Colateralmente, Tendo-se observado que a supressão de ACTH aumenta a expressão de caspase-3, indagou- se se a sua administração crónica a diminui.

4 Introdução-Índice A Glândula supra-renal Radicais livres e dismútase do superóxido A caspase-3

5 A glândula supra-renal (GSR) cai.md.chula.ac.th Ultra-estrutura das células do Córtex de GSR

6 A hormona adrenocorticotrófica A hormona adrenocorticotrófica (ACTH) é o maior estimulante da secreção das hormonas adrenocorticais, nomeadamente dos glicocorticóides (corticosterona e cortisol)

7 A glândula supra-renal (GSR) Glândula supra-renal Córtex Zona glomerulosa Mais externa Poucas gotas lipídicas e REL Produção de aldosterona Zona fasciculada Inúmeras gotas lipídicas contendo fosfolipídeos e colesterol Mitocôndrias vesiculadas Síntese de corticosterona Zona reticular Mais interna Mitocôndrias tubovesiculares Elevada quantidade de lisossomas e RER Síntese de androgénios, No ser humano Medula Células cromafins Síntese de adrenalina e noradrenalina Região com inúmeros sinusóides

8 Fontes e consequências dos radicais livres Fontes endógenas: Cadeia respiratória Reacções enzímicas Reacções de autooxidação Fontes exógenas: Fumo do tabaco Poluentes Luz UV Radiações ionizantes Xenobióticos Produção de radicais livres Metais de transição Peroxidação lipídica Modificações nas bases de DNA Alterações proteicas Lesão dos tecidos Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: (adaptação)

9 Defesas dos antioxidantes Produção de radicais livres Metais de transição Lesão dos tecidos Enzimas antioxidantes: dismútase do superóxidodismútase do superóxido catálase peroxídase da glutationa Proteínas que se ligam aos metais: transferrina ferritina lactoferrina Mecanismos de reparação Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: (adaptação) Outras substâncias: fases lipídicas: tocoferóis ubiquitinol carotenóides flavonóides fases aquosas ascorbato urato glutationa

10 A dismútase do superóxido, SOD Há 3 isoformas: Intracelulares SOD cobre-zinco (CuZnSOD) Massa molecular de 32 kDa Homodímero Encontrada em organelos e no citoplasma SOD manganésio (MnSOD) Massa molecular de 40 kDa Homotetrâmero Presente em mitocôndrias, nomeadamente de GSR Distingue-se da CuZnSOD pois não é inibida com cianeto

11 A dismútase do superóxido, SOD Extracelular SOD extracelular (EC-SOD) Massa molecular de 135kDa Tetrâmero Contém um átomo de Zn e Cu em cada subunidade Sintetizada em alguns tipos de células: - células endoteliais - fibroblastos

12 A caspase-3 Membro de uma família de proteases, com resíduos de cisteína (C) no seu local catalítico e que clivam proteínas-substrato no extremo carboxílico de resíduos de ácido aspártico (Asp). executora da morte celular programada - apoptose

13 A caspase-3 The Cell A Molecular Approach,Third Edition, Geoffrey M Cooper et al Lesões nas mitocôndrias Libertação do citocromo c e de moléculas pró-apoptóticas (Smac/Diablo) Citocromo c induz a formação do apoptossoma (Apaf-1 e Caspase-9) Activação de uma via de caspases pela caspase-9 Activação da caspase-3 Nota: Smac/ Diablo promovem a apoptose interferindo com a acção dos IAPs que são inibidores das caspases

14 A caspase-3 Célula Normal Célula apoptótica Molecular Cell Biology, Fourth edition, Lodish et al medidacte.timone.univ-mrs.fr/.../ apoptose.html

15 Métodos - Índice Introdução de bombas osmóticas Colheita e processamento de glândulas supra-renais: Microscopia de luz (imunocitoquímica) Microscopia electrónica

16 Introdução de Bombas Osmóticas Ratos machos Wistar 3 meses de idade Peso ~262g Bombas osmóticas Alzet®, com Soro fisiológico (SF) ACTH com concentração de 1mg/1mL

17 Introdução de Bombas Osmóticas Anestesia com Sevorane® a 5% em mistura oxigénio:ar de 1:2 Laparotomia mediana inferior Introdução das bombas na cavidade peritoneal Sutura da parede abdominal Aplicação de Bombas Osmóticas intraperitoniais: Estudo do efeito de endotoxina na microestrutura da glândula supra-renal do rato, Michel Sapateiro Luís, 2003

18 Recolha das supra-renais e preparação para microscopia Ao fim de 7 dias sacrificaram-se os animais por decapitação Microscopia óptica Microscopia óptica Fixaram-se porções de glândula supra-renal em formol Incluíram-se em parafina Fizeram-se cortes com micrótomo e colocaram-se estes em lâminas com poli-L-lisina Microscopia electrónica Microscopia electrónica Fixaram-se porções de glândula supra-renal com glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato Inclusão em EPON Fizeram-se cortes ultrafinos que se colocaram em grelhas e se coraram para observar no microscópio electrónico

19 Imunocitoquímica da MnSOD 1. Desparafinação dos cortes 2. Hidratação 3. Bloqueio da peroxídase endógena com a 3% 4. Bloqueio com BSA 2% em TBS 5. Incubação com Anti-MnSOD (anticorpo I de coelho) durante 24h 6. Incubação com anticorpo II, anti-coelho biotinilado durante 30 min 7. Adicionou-se o complexo ABC (Streptavidina Peroxídase) 8. Revelação com DAB 9. Contraste com Hematoxilina + Eosina 10. Mantagem com Entellan 11. Observação a microscopia de luz

20 Imunocitoquímica da Caspase-3 1. Desparafinação 2. Hidratação 3. Colocar os cortes em tampão de citrato até entrar em ebulição 4. Baixar a temperatura 5. Inibição da peroxídase endógena por adição a 3% 6. Bloqueou-se com BSA 5% em TBS-T 7. Adicionou-se anticorpo I de coelho durante 24h 8. Incubação 30 min com anticorpo II, anti-coelho, biotinilado 9. Incubação com complexo ABC 10. Revelação com DAB 11. Contraste com hematoxilina e eosina 12. Montagem com Entellan 13. Observação a microscopia de luz

21 Resultados -Índice Microscopia electrónica Microscopia óptica Cortes semi-finos Imunocitoquímica da SOD Imunocitoquímica da caspase-3

22 Microscopia óptica Cortes semi-finos ZG da GSR no animal controloZG na GSR no animal tratado com ACTH

23 Resultados Microscopia electrónica Inclusões lipídicas mitocôndrias GSR em que foi administrado soro fisiológico (SF) no animal GSR em que foi administrado ACTH no animal heterocromatina nucléolo REL

24 Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSOD Cápsula ZG ZF ZR medula córtex GSR do animal em que houve administração de ACTH

25 Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSOD ZF da GSR no controlo (SF) ZF da GSR no animal tratado com ACTH

26 Microscopia óptica Imunocitoquímica da caspase-3 Cápsula, ZG e ZF da GSR no animal controlo (SF) ZF da GSR no animal em o ACTH foi administrado cápsula ZG ZF

27 Conclusões A introdução de bombas osmóticas é tecnicamente fácil É necessário aumentar o número de animais para confirmar os dados observados; A administração de ACTH não altera a localização da expressão de MnSOD relativamente ao controlo e em ambos os casos há uma intensidade de marcação importante; A marcação da caspase-3 ocorreu em núcleos e citoplasma da ZF/ZR após administração crónica de ACTH. É possível que tal resulte de: Activação de processos apoptóticos, ainda sem expressão morfológica; Activação de uma via de sinalização não associada a morte celular, em que a caspase-3 parece estar também envolvida

28 Bibliografia [1] R.E. Kramer, W.E. Rainey; B, Funkenstein, A. Doee; E. R. Simpson, M.R. Waterman, Induction of syntisis of mitochondrial steroidogenic enzymes of bovine adrenocortical cells by analogs of cyclic AMP, J. Biol. Chem, 259 (1984) [2] S. Standring, H. Ellis; J. C. Healy, D. Jahnson, A. Williams, Grays Anatomy The Basis of Clinical Practice 39th Edition, Elsevier Churcill Livingstone, 2005 [3] D.M. Stocco, Tracking the role of a star in sky of a new millennium, Mol. Endocrinol. 15 (2001) [4] L.K. Christenson, J.F. Strauss III, Steroidogenic acute regulatory protein: an update on its regulation and mechanism of action. Arch Med. Res. 32 (2001) [5] H. Takemori, J. Doi, N. Horike, Y. Katoh, L. Min, X. Lin, Z. Wang, M. Muraoka, M. Okamoto, Salt-inducible kinase– mediated regulation of steroidogenisis at the early stage of ACTH-stimulation, J. Steroid Biochem and Mol. Biol. 85 (2003) [6] P. Val, C. Aiguesperse, B. Ragazzon, G. Veyssière, A. LeFrançois-Martinez, A. Martinez, Adrencorticotropin/3,5-Ciclic AMP-Mediated Transcription of the Scavenger akr1-b7 Gene in Adrenocortical Cells Is Dependent on three Functionaly Distinct Steroidogenic Factor -1ic Factor -1-Responsive Elements, Endocrinol. (2004), 145(2): [7] I. S. Young, J. V. Woodside, Antioxidants in health and disease, J Clin Pathol,54 (2001) [8] G.R. Buettner, The Pecking Order of Free Radicals and Antioxidants: Lipid Peroxidation, a-Tocopherol, and Ascorbate, Arch Biochem and Biophys, 2 (1993) [9] M.E. Rosenfeld, Inflammation, lipids, and free radicals: lessons learned from the atherogenic process, Semin Reprod Endocrinol, 16 (1998) [10] B. Halliwell, Vitamina C and Genomic stability, Mutation Research, 475 (2001) [11] O. Arrigoni, M.C. Tullio, Ascorbic acid: much more than just an antioxidant, Biochim et Biophis Acta, 1569 (2002) 1-9 [12] R.C. Rose, A.M. Bode, Biology of free radical scavengers: an evaluation of ascorbate, The FASEB Journal, 7 (Sep 1993) [13] A. Meister, Glutathione-Ascorbic Acid Antioxidant System in Animals, The journal of Biological Chemistry, 269:13 (1994) [14] R.A. Weisiger, I. Fridovich, Mitochondrial superoxide dismutase of site of synthesis in intramitochondrial location, J. Biol Chem 248 (1973) [15] S.L. Marklund, E. Holme, L. Hellner, Superoxide dismutase in extracelular fluids, Clin. Chim. Acta, 126 (1982) [16] G. M. Cooper, R. E. Hausman, The Cell a Molecular Approach, Sinauer, Third Edition [17] H. Lodish, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. E. Darnell, Molecular Cell Biology, 4th Edition

29 Agradecimentos Prof. Doutor Henrique Almeida Drªs Liliana Matos e Adriana Rodrigues D. Maria Amélia Ferreira e D. Elisa Galvão

30 Fim


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