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Engenharia do DNA María Julia Barison BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana Plasmodium falciparum.

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1 Engenharia do DNA María Julia Barison BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana Plasmodium falciparum USP

2 DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de sequencias derivadas de diferentes organismos. Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante. Aplicações: Medicina Produção de hormônios como insulina ou fatores de crescimento Produção de vacinas Pesquisa Produção de proteínas recombinantes knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais Estudos de expressão e localização subcelular (genes repórteres) Melhoramento animal e vegetal (OGMs)

3 1. Fragmento de DNA de interes + Vetor 2. DNA recombinante 3. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado

4 1. Fragmento de DNA de interes + Vetor DNA PCR Livrarias de DNA VETOR Plasmídeo Origem de replicação (ORI) Marcador de seleção (resistência a ATB) Polylinker (sítios de corte únicos para diferentes ER) Bacteriófago Lambda/Cosmidos BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) YAC Molecular Cell Biology, 5ta edição

5 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO TipoEstruturaCofatoresSítio de reconhecimento Sítio de corte Tipo IMultifuncional, várias subunidades Mg2+, ATP, AdoMet AsimétricoAleatóriamente, a distância médias de 1000 pb. Tipo IIRestrição e modificação em enzimas diferentes Mg2+PalindrómicosDentro da sequencia de reconhecimento*. Tipo IIIMultifuncional, várias subunidades Mg2+, ATP,AsimétricoA uma distância de pb da seq de reconhecimento. *Extremos produzidos pelas enzimas tipo II: Bickle and Krüger (1993); Molecular Cell Biology, 5ta edição

6 LIGASES OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM Vetores tipo T - ligação Clonagem por recombinação

7 Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado Transformação: Shock térmico Electroporação Molecular Cell Biology, 5ta edição

8 MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA Tipos de mutação: Pontual Deleção Inserção Mutação Pontual SilenciosaNonsenseMissense Sem Mutação conservativa Não -conservativa

9 ESTRATÉGIAS Sequencia de interes Introdução da mutação desejada + sítio de restrição Sítio de restrição que permitirá o screening de clones mutantes Introdução da mutação desejada Primer que introduzirá ou eliminará um sítio de restrição Se um sitio foi eliminado, ele pode ser utilizado para aumentar a proporção de clones mutados.

10 Sistema pALTER

11 Mutagênesis sítio dirigida mediante Overlap Extension PCR PCR Desnaturação Re-hibridação Extensão Amplificação Clonagem Ho, S. N et al (1989)

12 Screening dos clones mutados: Análise por digestão com enzimas de restrição Identificação do clone por hibridação com sonda marcada Hibridação com sonda marcada Sinal positivo Colonias de bacterias levando o plasmídeo mutado Membrana de nitrocelulosa Incubação da membrana com solução alcalina DNAss unido à membrana Adaptado de Molecular Cell Biology, 5ta edição

13 Obrigada pela atenção!!...

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