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EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

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Apresentação em tema: "EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA"— Transcrição da apresentação:

1 EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
Leonardo R. Silveira Universidade de São Paulo Escola de Educação Física e Esportes – Ribeirão Preto

2 Histórico Primeiras evidências de que o DNA é o material genético:
F. Miescher, extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein). O. Hertwing, demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos. O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético

3 1950: Não conhecia a seqüência de amino ácidos de nenhuma proteína. - Não sabia que os amino ácidos numa proteína permanecem arranjados numa seqüência exata.

4 Nature - 25 de abril de 1953 “A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid” J. Watson and W. Crick
“We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”

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6 1960: Foi definida a primeira estrutura tridimensional
1960: Foi definida a primeira estrutura tridimensional de uma proteína, definida por cristalografia. Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes que as codifica.

7 A informação genética consiste primariamente em instruções para fazer proteínas!
A informação genética de todos os animais é escrita na linguagem universal das seqüências de DNA, e a seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas simples, que hoje praticamente todos os laboratórios de pesquisa podem dominar.

8 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
cytosine

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11 O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos enroladas em hélice
As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que ser ANTIPARALELAS O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio

12 O DNA é uma molécula com polaridade:uma extremidade 5’- P e uma extremidade 3’-OH
A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO 5’  3’

13 Interações fracas entre macromoléculas (interações de curta distância)
Ligações de van der Waals Ligações eletrostáticas Ligações (pontes) de Hidrogênio Interações Hidrofóbicas

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19 I II III IV e Acetil - CoA TCA Cycle Extrac Cytosol F0 O H FA CoA b
GLUT Glucose G 6 P Pyruvate Lactate Extrac Cytosol NAD FAD NADH FADH 2 I II III IV e - F0 + ( Δ y ) pH) ADP/ATP Transporter Muscle activity Active transporte Biosynthesis Metabolism O H ADP+Pi ATP CPT - I FA CoA b Oxid II CAT FFAT FFA Facyl

20 (-) (-) (-) HK (-) Lactate Glucose cytosol PDH M. matrix
FFA FATp GT cytosol HK (-) Glucose-6P FFA (-) FFA Fructose-6P Fatty acyl-CoA PFK ACC (-) Malonyl-CoA Fructose-1,6-bi-P (-) Acetyl-CoA Pyruvate Lactate CPTI translocase PDH CPTII PC (-) Acetyl-CoA -oxidation acyl-CoA oxaloacetate citrate malate isocitrate fumarate 2-oxoglutarate succinate M. matrix Succinyl-CoA Randle and Newsholme, Lancet, 1963

21 Oxidação de glicose e AG
Consumo de glicogênio ÁCIDOS GRAXOS Glicose leve moderada intensa

22 Muscle & Nerve, 2009 (in press)
Table 2. Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation. lymphocyte gene expression after DHA-rich fish oil supplementation. Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation. Gene bank Gene name ES/ CL/ accession Ct Ct number Metabolism M22413 Carbonic anhydrase 3 8,5 1,3 M31788 Phosphoglycerate kinase 1 5,7 1,2 U73525 Thioredoxin 2 19,5 6,4 Y00404 Superoxide dismutase 1 23,9 5,5 M11670 Catalase 14,0 8,0 X56600 Superoxide dismutase 2 31,8 14,3 D12770 Solute carrier family 25 (mitochondrial adenine nucleotide 7,4 1,3 translocator) member 4 U09540 Cytochrome P450, subfamily 1B, polypeptide 1 4,1 1,7 M21208 Cytochrome P450, subfamily 17 13,6 6,9 L03294 Lipoprotein lipase 7,7 2,9 J04171 Glutamate oxaloacetate transaminase 1 6,7 1,4 M18467 Glutamate oxaloacetate transaminase 2 6,6 3,0 J05405 Heme oxygenase 2 6,2 3,5 D30647 Acyl - Coenzyme A dehydrogenas e, very long chain 4,5 1,7 U22424 Hydroxysteroid 11 - beta dehydrogenase 2 17,1 7,7 M23995 Aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 8,6 4,7 X15958 Enoyl Coenzyme A hydratase, short chain 1 24,7 9,4 J05029 Acetyl - Coenzyme A dehydrogenase, long - ch ain 15,7 7,0 D30035 Peroxiredoxin 1 20,6 6,1 X12367 Glutathione peroxidase 1 6,2 1,1 Muscle & Nerve, 2009 (in press)

23 Eletroforese Bidimensional
PROTEOMA

24 Exercício Físico Transcrição Gênica Adaptações celulares

25 Neufer PD and Dohm GL. Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 265: C1597–C1603, 1993.

26 Transportadores de glicose
Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

27 Enzima citrato sintase

28 Efeito agudo do exercício na transcrição gênica
Pilegaard et al., 2000

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31 Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular

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34 Free Radical in Biology and Medicine, 43(3):353-61, 2007.

35 Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular
European J. Appl. Physiol., 102(1):119-26, 2007.

36 Efeito da disponibilidade de nutrientes na transcrição gênica
Pilegaard et al., 2002

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38 Efeito da elevada disponibilidade de lipídios

39 Silveira et al., 2008

40 Adaptações ao exercício Crônico

41 (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- coactivator 1)
PGC- 1 (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- coactivator 1) Puigserver P & Spiegelman BM (2003). Endoc Reviews 24,

42 Sinalização intracelular
Hood DA et al., 2001

43 Hood DA et al., 2001

44 Narkar et al., Cell, 2008

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46 AICAR

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48 EFFECT OF ROS ON BASAL GENE EXPRESSION

49 Efeito da contração muscular e do tratamento antioxidante

50 EFFECT OF ROS INDUCED BY CHRONIC MUSCLE CONTRACTION AND ANTIOXIDANTS TREATMENT ON GENE EXPRESSION

51 Efeito acumulativo da transcrição sobre expressão de proteína
20 40 Dias de Treinamento % acima do controle RNAm proteína 80 100 1 2 3 4 20 40 Dias de Treinamento % acima do controle RNAm 80 100 1 2 3 4 20 40 Dias de Treinamento % acima do controle RNAm 60 80 100 1 2 3 4 20 40 Dias de Treinamento % acima do controle RNAm 100 100 1 2 3 4 20 40 Dias de Treinamento % acima do controle 20 40 Dias de Treinamento % acima do controle 80 80 60 60 % acima do controle RNAm 40 20 Dias de 1 1 2 2 3 3 4 4 Treinamento Silveira, L. R. ; Pilegaard, H. ; Kusuhara, K. ; Curi R ; Hellsten, Y. BBA ( Molecular Cell Research) 1763: , 2006.

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54 Estresse oxidativo e sistema antioxidante em músculo de animais treinados

55 Am J Physyol, 2002

56 Intracellular sources of ROS and RNS in skeletal muscle
extracellular NO Arginine + O NOS Citruline + NO 2 ONOO. ONOO - ONOO - XO Arachidonic acid O - 2 O - 2 SOD mitochondria .OH H + CAT H O O - H O H O 2 H O 2 SOD 2 2 2 2 2 2 “Fe2+” GSH-PX “Fe2+” “Fe2+” H O (+) 2 OH OH Protein oxidation Gene expression O2 Peroxysome NADPHoxidase Lipid peroxidation PMN O-2 Ca++ MPO (-) Cl- + H2O2 antioxidants HOCl XO Arq. Bras.Endoc.Metab. 48(6): , 2004

57 Hipótese Alteração do balanço redox afeta o metabolismo de ácido graxo e glicose no músculo esquelético durante a contração.

58 RAT SKELETAL MUSCLE CELL CULTURE

59 *** Produção de H2O2 em Células Musculares Esqueléticas *
90 80 70 60 * 50 Fluorescência 40 30 20 10 Controle NAC (1 mM) Incubação com Amplex + HRP

60

61 In vitro ROS detection * * * * * Fluorescence control Basal stimulated
20 40 60 80 100 130 Basal stimulated p < 0.05 p < 0.01 Control NAC GPX + GSH + CAT Fluorescence * 50 100 150 200 control H2O2 # # * * * * GPX/GSH/CAT (Fluorescência) O 2

62 Metabolismo de glicose
Efeito do tratamento antioxidante na expressão e no conteúdo de GLUT4 em condição basal 10000 20000 30000 não estimulado Unidades control NAC * 46 kDa - A.U 50 100 Control NAC GLUT- 4/GAPDH mRNA (%) *

63 Expressão do GLUT4 mediada por contração
Controle 12 horas 25 50 75 100 125 150 175 3h 12h 24h p <0.05 * GLUT- 4/GAPDH mRNA (%) p <0.05 * 150 100 GLUT- 4/GAPDH mRNA (%) 50 Control H2O2 Sem tratamento e não estimulado H O 2 2 3h Control Stimulated NAC Stimulated + NAC

64 Efeito da contração no conteúdo de GLUT4
46 kDa - p <0.05 * 46 kDa - 30000 # 20000 * 35000 30000 Unidades 10000 25000 20000 15000 Basal Stimulated 10000 5000 Sem NAC Controle Basal H2O2 H O 2 2 Control NAC

65 Transporte de glicose H2O2 Control NAC p <0.05 p <0.05 0.3
H]-D-glicose 0.2 Captação de (µmol/mg de proteína) 3 0.1 2-desoxi-[2.6- 0.0 H2O2 Basal Stimulated O 2 2 Control NAC

66 Expressão da HK-II mediada por contração
* * 175 150 125 150 HKII/GAPDH mRNA (%) 100 100 75 50 50 25 3h 12h 24h Control H2O2 3h Sem tratamento e NAC Control Stimulated NAC Stimulated + NAC

67 Atividade da HK Hexokinase p <0.05 4 (nmol/min/mg de proteina) 3 2
1 2 3 4 Basal Stimulated p <0.05 H2O2 Hexokinase (nmol/min/mg de proteina) Control NAC

68 Expressão da PFK-I mediada por contração
* * 1.3 1.2 1.0 1.0 0.8 PFK/GAPDH mRNA (%) 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 Control H2O2 0.0 3h 24h 12h 3h Control Stimulated Stimulated + NAC

69 Atividade da PFK * Phosphofructokinase Control NAC (nmol/min/mg) 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Basal Stimulated H2O2 * Phosphofructokinase (nmol/min/mg) Control NAC

70 Lactate * * * * (µmol/µg protein) Basal Stimulated H2O2 Control NAC
0.035 * 0.030 0.025 0.020 (µmol/µg protein) 0.015 0.010 0.005 0.000 Basal Stimulated H2O2 Control NAC

71 Metabolismo de ácido graxo
Expressão da CPT-I Control NAC 50 100 150 200 250 * CPT-I/GAPDH mRNA (%)

72 Conteúdo de CPT-I 10000 20000 30000 AU Control NAC 88 kDa

73 Expressão de CPT-I mediada por contração
* 50 100 150 200 250 * * 100 * CPT-I/GAPDH mRNA (%) 50 3h 12h 24h Basal H2O2 NAC Control Stimulated NAC Stimulated + NAC

74 Efeito da contração muscular no conteúdo de CPT-I
10000 20000 30000 AU * 88 kDa - Basal Stimulated 88 kDa - 30000 AU 20000 10000 H2O2 Basal P >0.05 NAC Control * P < 0.05 compared to basal

75 Oxidação de palmitato * * * production Stimulated H2O2 Basal
0.10 # (umol/mg protein) 0.05 ] 2 CO 14 [ 0.00 Basal Stimulated H2O2 Control NAC

76 Experimentos in vivo preparação -30 30 90 60 120 min Músculo S1 S2 S3
- Anestesia Cânula Infusão - salina AGCL Est. Elétrico (+) Est. Elétrico (-) -30 30 90 60 120 min

77 Efeito do tratamento antioxidante na força de contração muscular
Contrações Intensas 10 20 30 40 50 60 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 Tempo (s) Grama-força/kg 10 20 30 40 50 60 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Tempo (s) Control NAC

78 Força de contração máxima
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 * Grama-força/kg Control NAC

79 Resistência à Fadiga * Force (%) * * * Control 125 NAC 100 75 50 10 20
10 20 30 40 50 60 70 Time (min)

80 Detecção de EROs em músculo incubado em Krebs (95% O2 + 5% CO2)
Controle Contração 50 100 150 200 250 * # Fluorescência por grama de peso muscular (% do controle) NAC Control

81 Conclusão Oxidação de glicose e AG Consumo de glicogênio ÁCIDOS GRAXOS
Aumento ROS Menor atividade antiox Aumento Glut-4 Aumento Enz. glicolíticas Captação de glicose Aumento de força Maior ativ antioxidante Menor produção ROS Aumento de CPT-I Aumento da -oxidação Aumento da resistência Oxidação de glicose e AG Consumo de glicogênio ÁCIDOS GRAXOS Glicose leve moderada intensa

82 Silveira LR et al. (2008) J. Cell Physiol

83 Doenças metabólicas Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

84 I II III IV H e Matriz M. Ext I II III IV H e - Matriz + O O  μ H Δ
ATP/ADP e - + O 2 O Matriz M. Ext NADH FADH Δ μ H + I II III IV H ATP/ADP e - + O 2 O Matriz Desacoplador Reid & Durham. Annual NY Acad Sci 2003.

85 JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 210:7–15 (2007)

86 Silveira LR et al., Cell Physiol Biochem, 2007
* * 2 min 20 nMoles O2 10.1 15.8 16.1 9.4 SMM GDP BSA Lipovenos Silveira LR et al., Cell Physiol Biochem, 2007

87 Experimentos in vitro RADIOATIVO PRÉ-INCUBAÇÃO Tempo (h)
Glicose (5 mM) Insulina (100uU/mL) Palmítico (1 mM) RADIOATIVO PRÉ-INCUBAÇÃO 1 - Glicose Glicose 2 - Glicose Glicose + Insulina 3 - Glicose + Insulina Glicose + Insulina Glicose + Insulina 4 - Glicose + Palmítico (1mM) Glicose + Insulina +Palmítico 5 - Glicose 6 - Glicose + Insulina + Palmítico Glicose + Insulina 5 4 Tempo (h)

88 Captação de glicose

89 Após 4h de incubação

90 NADPH oxidase – P47 47 Kda - 37 Kda - 25 Kda - N N - - + +
(+) palmitate (N) positive control

91 37 kda - 29 kda - 19 kda - 6.6 kda - c c p p (c) control (p) Palmitic acid

92 Biochimica Biophysica Acta 1757:57–66, 2006.

93 Cell Biochem Function, 2006

94 Resitência à Insulina e Atividade Mitocondrial

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96 Biochem Nutrition, 2009 (submitted)

97 PROJETOS EM ANDAMENTO 1. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA NO CICLO DO ÁCIDO TRICARBOXÍLICO E SECREÇÀO DE INSULINA EM RATOS OBESOS Cláudio C. Zoppi 2. EFEITO DA CONTRAÇÃO MUSCULAR E DO TRATAMENTO ANTIOXIDANTE NA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA MITOCONDRIAL E NO CONTEÚDO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE (GLUT-1/4) EM CULTURA DE CÉLULAS MUSCULARES EXPOSTAS AO ÁCIDO PALMÍTICO Felipe N Damas 3. ANAPLEROSE COMO REGULADORA DA ATIVIDADE MITOCONDRIAL E DA SENSIBILIDADE A INSULINA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO Josiane Miranda

98 Agradecimentos Laboratório de Fisiologia Celular Dr. Rui Curi
Laboratório de Pâncreas e Endócrino e Metabolismo Dr. Everardo M Carneiro Dr. Antônio C. Boschero - Laboratório Bioenegética Dr Aníbal Vercesi Dra Luciane C Alberici -Copenhagen Muscle Research Center Dra Ylva Hellesten Dr. Jens Bangsbo Dra. Heriette Pilegaard - Fapesp, Capes e CNPq.


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