A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Universidade de São Paulo Escola de Educação Física e Esportes – Ribeirão Preto Leonardo R. Silveira EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Universidade de São Paulo Escola de Educação Física e Esportes – Ribeirão Preto Leonardo R. Silveira EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO."— Transcrição da apresentação:

1 Universidade de São Paulo Escola de Educação Física e Esportes – Ribeirão Preto Leonardo R. Silveira EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

2 Histórico Primeiras evidências de que o DNA é o material genético: F. Miescher, extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein). O. Hertwing, demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma –Hertwing suspeitou que nuclein fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos. O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético

3 1950: -Não conhecia a seqüência de amino ácidos de nenhuma proteína. - Não sabia que os amino ácidos numa proteína permanecem arranjados numa seqüência exata.

4 Nature - 25 de abril de 1953 A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid J. Watson and W. Crick We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….

5

6 1960: Foi definida a primeira estrutura tridimensional de uma proteína, definida por cristalografia. Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes que as codifica.

7 A informação genética consiste primariamente em instruções para fazer proteínas! A informação genética de todos os animais é escrita na linguagem universal das seqüências de DNA, e a seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas simples, que hoje praticamente todos os laboratórios de pesquisa podem dominar.

8 cytosine ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

9

10

11 O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos enroladas em hélice As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que ser ANTIPARALELAS O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio

12 O DNA é uma molécula com polaridade:uma extremidade 5- P e uma extremidade 3-OH A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO 5 3

13 Interações fracas entre macromoléculas (interações de curta distância) Ligações de van der Waals Ligações eletrostáticas Ligações (pontes) de Hidrogênio Interações Hidrofóbicas

14

15

16

17

18

19 CPT-I FA-CoA - Oxid CPT-II CAT FFAT FFA Facyl-CoA CPT-I FA-CoA - CPT-II CAT FFAT FFA Facyl-CoA

20 FFA Fatty acyl-CoA CPTI CPTII translocase acyl-CoA -oxidation FATp GT Glucose-6P Fructose-6P Fructose-1,6-bi-P PFK Glucose Pyruvate cytosol M. matrix Lactate HK Acetyl-CoA oxaloacetate citrate isocitrate 2-oxoglutarate Succinyl-CoA succinate fumarate malate (-) PC (-) FFA Randle and Newsholme, Lancet, 1963 Malonyl-CoA Acetyl-CoA (-) PDH ACC

21 leve Consumo de glicogênio Glicose ÁCIDOS GRAXOS moderada intensa Oxidação de glicose e AG

22 Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation. Table 2. Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation. lymphocyte gene expression after DHA-rich fish oil supplementation. Gene bank accession number Gene name ES/ Ct CL/ Ct Metabolism M22413 Carbonic anhydrase 3 8,5 1,3 M31788 Phosphoglycerate kinase 1 5,7 1,2 U73525 Thioredoxin 2 19,5 6,4 Y00404 Superoxide dismutase 1 23,9 5,5 M11670 Catalase 14,0 8,0 X56600 Superoxide dismutase 2 31,8 14,3 D12770 Solute carrier family 25 (mitochondrial adenine nucleotide translocator) member 4 7,4 1,3 U09540 Cytochrome P450, subfamily 1B, polypeptide 1 4,1 1,7 M21208 Cytochrome P450, subfamily 17 13,6 6,9 L03294 Lipoprotein lipase 7,7 2,9 J04171 Glutamate oxaloacetate transaminase 1 6,7 1,4 M18467 Glutamate oxaloacetate transaminase 2 6,6 3,0 J05405 Heme oxygenase 2 6,2 3,5 D30647 Acyl-Coenzyme A dehydrogenase, very long chain 4,5 1,7 U22424 Hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 17,1 7,7 M23995 Aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 8,6 4,7 X15958 Enoyl Coenzyme A hydratase, short chain 1 24,7 9,4 J05029 Acetyl-Coenzyme A dehydrogenase, long-chain 15,7 7,0 D30035 Peroxiredoxin 1 20,6 6,1 X12367 Glutathione peroxidase 1 6,2 1,1 Muscle & Nerve, 2009 (in press)

23 Eletroforese Bidimensional PROTEOMA

24 Exercício Físico Transcrição Gênica Adaptações celulares

25 Neufer PD and Dohm GL. Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 265: C1597–C1603, 1993.

26 Transportadores de glicose Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

27 Enzima citrato sintase

28 Pilegaard et al., 2000 Efeito agudo do exercício na transcrição gênica

29

30

31 Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular

32

33

34 Free Radical in Biology and Medicine, 43(3):353-61, 2007.

35 European J. Appl. Physiol., 102(1):119-26, Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular

36 Pilegaard et al., 2002 Efeito da disponibilidade de nutrientes na transcrição gênica

37

38 Efeito da elevada disponibilidade de lipídios

39 Silveira et al., 2008

40 Adaptações ao exercício Crônico

41 Puigserver P & Spiegelman BM (2003). Endoc Reviews 24, PGC- 1 (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- coactivator 1 )

42 Sinalização intracelular Hood DA et al., 2001

43

44 Narkar et al., Cell, 2008

45

46 AICAR

47

48 EFFECT OF ROS ON BASAL GENE EXPRESSION

49 Efeito da contração muscular e do tratamento antioxidante

50 EFFECT OF ROS INDUCED BY CHRONIC MUSCLE CONTRACTION AND ANTIOXIDANTS TREATMENT ON GENE EXPRESSION

51 Efeito acumulativo da transcrição sobre expressão de proteína Dias de Treinamento % acima do controle RNAm Dias de Treinamento % acima do controle RNAm Dias de Treinamento % acima do controle RNAm Dias de Treinamento % acima do controle RNAm Dias de Treinamento % acima do controle Dias de Treinamento % acima do controle Dias de Treinamento % acima do controle RNAm proteína Silveira, L. R. ; Pilegaard, H. ; Kusuhara, K. ; Curi R ; Hellsten, Y. BBA ( Molecular Cell Research) 1763: , 2006.

52

53

54 Estresse oxidativo e sistema antioxidante em músculo de animais treinados

55 Am J Physyol, 2002

56 Intracellular sources of ROS and RNS in skeletal muscle Arginine+ O 2 Citruline+ NO PMN O - 2 SOD H 2 O 2 H + · OH O - 2 H 2 O 2 ONOO - NO ONOO - H 2 O 2 · OH O - 2. OH HOCl MPO SOD H 2 O CAT H 2 O GSH-PX intracellular extracellular ONOO. Fe 2 + Cl - + H 2 O 2 O-2O-2 O2O2 Lipid peroxidation Gene expression antioxidants (+) (-) Ca ++ Protein oxidation XO Arachidonic acid mitochondria Peroxysome NADPH oxidase XO Arq. Bras.Endoc.Metab. 48(6): , 2004 NOS

57 Hipótese Alteração do balanço redox afeta o metabolismo de ácido graxo e glicose no músculo esquelético durante a contração.

58 RAT SKELETAL MUSCLE CELL CULTURE

59 Produção de H2O2 em Células Musculares Esqueléticas ControleNAC (1 mM) *** Incubação com Amplex + HRP Fluorescência *

60

61 In vitro ROS detection 2 O (Fluorescência) GPX/GSH/CAT * control H2O2 # Basalstimulated p < 0.05 p < 0.01 Control NAC GPX + GSH + CAT Fluorescence * * * * #

62 Efeito do tratamento antioxidante na expressão e no conteúdo de GLUT4 em condição basal Control NAC GLUT- 4/GAPDH mRNA (%) * não estimulado Unidades control NAC * 46 kDa - A.U Metabolismo de glicose

63 Expressão do GLUT4 mediada por contração Control Stimulated NAC Stimulated + NAC Controle 12 horas Controle h 12h 24h p <0.05 * GLUT- 4/GAPDH mRNA (%) p <0.05 Sem tratamento e não estimulado H 2 O 2 ControlH2O2 * 3h

64 Efeito da contração no conteúdo de GLUT4 Sem NAC NAC ControleH 2 O Basal Stimulated p <0.05 Unidades * # Control Basal H2O2 * 46 kDa -

65 Transporte de glicose Basal Stimulated 2 O 2 p <0.05 Control NAC Captação de 2-desoxi-[ H]-D-glicose (µmol/mg de proteína) H2O2 p <0.05

66 Expressão da HK-II mediada por contração NAC Control Stimulated NAC HKII/GAPDH mRNA (%) Sem tratamento e 3h12h24h * * Stimulated + NAC ControlH2O2 3h

67 Atividade da HK Hexokinase (nmol/min/mg de proteina) Control NAC Basal Stimulated p <0.05 H2O2 p <0.05

68 Expressão da PFK-I mediada por contração ControlH2O * 3h 12h 24h PFK/GAPDH mRNA (%) Control Stimulated Stimulated + NAC * 3h

69 Atividade da PFK Phosphofructokinase (nmol/min/mg) Control NAC BasalStimulatedH2O2 * * * *

70 Lactate Control NAC (µmol/µg protein) BasalStimulated H2O2 * * * *

71 Expressão da CPT-I ControlNAC * CPT-I/GAPDH mRNA (%) Metabolismo de ácido graxo

72 Conteúdo de CPT-I AU ControlNAC 88 kDa

73 Expressão de CPT-I mediada por contração NAC Control Stimulated NAC Stimulated + NAC 3h 12h24h CPT-I/GAPDH mRNA (%) * * * * P > 0.05 BasalH2O2

74 Efeito da contração muscular no conteúdo de CPT-I NAC Control AU * 88 kDa - Basal Stimulated * * P < 0.05 compared to basal AU 88 kDa - Basal H2O2 P >0.05

75 Oxidação de palmitato [ 14 CO 2 ] (umol/mg protein) production Control NAC Basal Stimulated H2O2 * ** #

76 Músculo Experimentos in vivo min - Anestesia - Cânula Infusão - salina - AGCL Est. Elétrico (+) Est. Elétrico (-) S1 S4 S5 S2 S3 preparação

77 Contrações Intensas Efeito do tratamento antioxidante na força de contração muscular Grama-força/kg Tempo (s) Tempo (s) Control NAC

78 * Grama-força/kg Control NAC Força de contração máxima

79 Resistência à Fadiga NAC Control Time (min) Force (%) * * * *

80 Detecção de EROs em músculo incubado em Krebs (95% O 2 + 5% CO 2 ) Controle Contração * # * Fluorescência por grama de peso muscular (% do controle) NAC Control

81 Conclusão leve Consumo de glicogênio Glicose ÁCIDOS GRAXOS moderada intensa Oxidação de glicose e AG - Aumento ROS - Menor atividade antiox -Aumento Glut-4 - Aumento Enz. glicolíticas -Captação de glicose - Aumento de força - Maior ativ antioxidante - Menor produção ROS - Aumento de CPT-I - Aumento da -oxidação -Aumento da resistência

82 Silveira LR et al. (2008) J. Cell Physiol

83 Doenças metabólicas Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

84 Reid & Durham. Annual NY Acad Sci Δ μ H + IIIIII IV H + ATP/ADP e-e- e - + O 2 H 2 O Matriz O 2 Desacoplador H + H + H + H +

85 JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 210:7–15 (2007)

86 2 min 20 nMoles O SMMGDP BSA Lipovenos * * Silveira LR et al., Cell Physiol Biochem, 2007

87 1 - Glicose Glicose 2 - Glicose Glicose + Insulina 3 - Glicose + Insulina Glicose + Insulina 4 - Glicose + Palmítico (1mM) 5 - Glicose Glicose + Insulina 6 - Glicose + Insulina + Palmítico Glicose + Insulina +Palmítico Glicose + Insulina PRÉ-INCUBAÇÃO RADIOATIVO Tempo (h) -Glicose (5 mM) - Insulina (100uU/mL) - Palmítico (1 mM) Experimentos in vitro

88 Captação de glicose

89 Após 4h de incubação

90 NADPH oxidase – P47 47 Kda - 37 Kda - 25 Kda - N N (+) palmitate (N) positive control

91 37 kda - 29 kda - 19 kda - c c p p (c) control (p) Palmitic acid 6.6 kda -

92 Biochimica Biophysica Acta 1757:57–66, 2006.

93 Cell Biochem Function, 2006

94 Resitência à Insulina e Atividade Mitocondrial

95

96 Biochem Nutrition, 2009 (submitted)

97 3. ANAPLEROSE COMO REGULADORA DA ATIVIDADE MITOCONDRIAL E DA SENSIBILIDADE A INSULINA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO Josiane Miranda 2. EFEITO DA CONTRAÇÃO MUSCULAR E DO TRATAMENTO ANTIOXIDANTE NA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA MITOCONDRIAL E NO CONTEÚDO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE (GLUT-1/4) EM CULTURA DE CÉLULAS MUSCULARES EXPOSTAS AO ÁCIDO PALMÍTICO Felipe N Damas 1. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA NO CICLO DO ÁCIDO TRICARBOXÍLICO E SECREÇÀO DE INSULINA EM RATOS OBESOS Cláudio C. Zoppi PROJETOS EM ANDAMENTO

98 Agradecimentos - Laboratório de Fisiologia Celular Dr. Rui Curi -Laboratório de Pâncreas e Endócrino e Metabolismo Dr. Everardo M Carneiro Dr. Antônio C. Boschero - Laboratório Bioenegética Dr Aníbal Vercesi Dra Luciane C Alberici -Copenhagen Muscle Research Center Dra Ylva Hellesten Dr. Jens Bangsbo Dra. Heriette Pilegaard - Fapesp, Capes e CNPq.


Carregar ppt "Universidade de São Paulo Escola de Educação Física e Esportes – Ribeirão Preto Leonardo R. Silveira EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google