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EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013.

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1 EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013

2 Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP 1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL; 2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV

3 Porcentagem de Descarte - HIV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%) Obs.:2004 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

4 Porcentagem de Descarte - HCV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) Obs.:2008 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

5 FPS 2010 ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%

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8 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático Anticorpos anti-HIV Antígeno p Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24Dia 16 Anticorpos anti-HIVDia 22 DT = 21.5 hrs blip viremia 2 nd gen 1 nd gen 3 rd gen

9 11.3/MILHÃO = 1:88.500

10 Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue Eu doo sangue para ter meus resultados Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de buscadores de teste!

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15 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático Anticorpos anti-HIV Antígeno p Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24Dia 16 Anticorpos anti-HIVDia 22 DT = 21.5 hrs blip viremia 2 nd gen 1 nd gen 3 rd gen

16 Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil Port. 262 M.S. 02/ introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado pool de 8 amostras Port M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios Port / adiada por 1 ano Port / Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV. Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.

17 –Plataforma multiplex para HCV e HIV; –Pool de 6 amostras; – estudos-piloto - SC – Estudos multicêntricos (outros hemocentros brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística. –Registro em 12/2010 –01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE, RJ e SP –14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA). Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos

18 blood units/day (based on the # of serology tests) 30 ¬ ¬ ¬ ¬ ¬ ¬ ¬ 2000 BUT … São Paulo State – due to size and complexity … will be addressed further ! How to? Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on: Easiness for primary tube logistics and report return within platelet saving time (<24h) Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already established for serology tests. Manaus, 376 Belém, 349 Campo Grande, 629 Brasília, 773 Salvador, 438 Curitiba, 769 Fortaleza, 646 Recife, 942 Florianópolis, 1115 B.Horizonte, 1192 Rio de Janeiro, 1083 São Paulo 1923

19 Manual Operacional NAT Sítio Testador (SIT) –24 horas para resultado após o recebimento –Encaminhar tubo para coleta –Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia –Relatório para o SIT –Distribuição dos tubos para UCA –Coleta e centrifuga amostra –Conservar em geladeira Unidade Coletora de Amostra (UCA) –Relatório para a URA –Coleta e centrifuga amostra –Conservar em geladeira

20 Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos Pooling – 2h Extração – 2h e 30min PCR Setup –30min Amplificação– 3h Tempo total 9h 30 min - 20ºC 30 min + 22ºC

21 NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Tubo primário - PPT Pool – 6 amostras Plataforma automática Janus Perkin Elmer

22 Protocolo de rotina TOTALPOOLSINGLE

23 NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Adição da partícula calibradora Extração – Biorobô MDx (T. lise e protease, temp 65ºC) Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) – PCR tempo real Applied Biosystems 7300

24 NAT FPS Total doações

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29 Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca) Amostra em SINGLE Ct : 32,54 - Processada dia 17 de março de 2011

30 HCV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = (FPS+HS) Total de resultados reagentes: 1052 Prevalência = 0.05% EIA Ac/Ag ReagenteNão Reagente NAT Detectável (falso positivos NAT) NAT Não Detectável Negativo

31 HIV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = (FPS+HS) Total de resultados reagentes 1065 Prevalência = 0.04% Ac/Ag 2 testes EIA + CMIA ReagenteNão Reagente NAT Detectável (falso positivo NAT) 1 janela em abril de 2013 NAT Não Detectável

32 PFcoletaamostrabolsaCTretornoEIAWBNAT /12/ /01/2011NNRN 11/02/2011NNRN /12/ /12/ /12/2010NNRN 05/02/2011NNRN /12/ /02/2011NNRN /12/ /12/2010NNRN /12/ /03/2011NNRN /12/ /12/2011NNRN /12/ /12/ /01/ /02/2012NNRN /01/ /02/2011NNRN /01/ /01/ /01/ /03/2011NNRN /01/ /03/2012NNRN /01/ /03/2011NNRN /01/ /02/2011NNRN 18/04/2011NNRN /02/ /03/2011NNRN 15/04/201NNRN /03/ /03/ /04/2011NNRN 06/05/2011NNRN /04/ /41/ND09/05/2011NNRN /06/ /53/ND27/07/2011NNRN /07/ /11/2011NNRN /07/ /52/ND10/08/2011NNRN /07/ /54/ND /07/ /55/ND31/08/2011NNRN /09/ /50/ND19/10/2011NNRN /09/ /47/ND21/10/2011NNRN /09/ /59/ND08/02/2012NNRN HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT

33 Testes : Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia BioRad: Genscreen ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA) Teste de Western Blot: MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2 SOROCONVERSÃO - HIV gp120 gp160 p17p24Banda controle 16/04/1303/05/1314/05/13 Quimio (S/CO) NR571,9908,470 ELISA (DO)NR3,0002,784 NAT (CT)32,017,85622,848 W. BLOT -INDPOS matriz capsídeo gp41 gp120 envelope CD4 CCR5 CXCR4 transcriptase reversa RNA viral Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP Última Doação Negativa: 02/08/2011 Sexo: masculino Idade: 36 anos

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35 Teste NAT - 17/04/2013 Pool de 6 amostras - CT: 34,6374

36 Teste NAT - 18/04/2013 Amostra única - CT: 32,8703

37 Teste NAT - 03/05/2013 Amostra única – CT: 17,856

38 Teste NAT - 17/05/2013 Amostra única – CT: 22,848

39 RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1: OBSERVADO = 1:

40 RENDIMENTO NAT NO BRASIL N AMOSTRAS CASOS WP TAXA HCV : HIV : LEVI ET AL., HEMO 2011

41 RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1: RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:

42 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS. Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas. Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou soroconversão para HIV e NAT+.

43 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS DATAANTI-HIVNATCARGA VIRAL 28/09/2012NEG INDETECTÁVEL 17/12/2012POS 39,658 cps/mL

44 HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press Número de réplicas Cobas MPX N+ Procleix N+ Bio-Manguinhos N+ Pura Diluida 1:65010 Plasma Negativo 1000 CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL

45 Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático Anticorpos anti-HIV Antígeno p Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24Dia 16 Anticorpos anti-HIVDia 22 DT = 21.5 hrs blip viremia 2 nd gen 1 nd gen 3 rd gen Infecção

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