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Resistência Bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica ) uso generalizado.

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1 Resistência Bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica ) uso generalizado e maciço de antibióticos e acontece quer estes sejam usados para tratar infecções, quer como profilaxia ou como promotores do crescimento animal Hoje em dia a resistência bacteriana é um grave problema sanitário, no entanto, a resistência aos antibióticos é conhecida à pelo mais ou menos 60 anos quase logo desde a descoberta do 1º antibiótico, como todos sabemos a penicilina. Este problema devia ter sido previsto mais cedo pois já desde a descoberta do DDT se previa a existencia de organismos resistentes e de possiveis mutações genéticas como se encontrou nas moscas No entanto o grave problema sanitário actual advem do uso generalizado e maciço de antibióticos e acontece quer estes sejam usados para tratar infecções, quer como profilaxia ou como promotores do crescimento animal. Desde que Alexander Fleming descobriu o primeiro antibiótico, a penicilina, em 1928, o homem e a bactéria disputam uma corrida e a liderança da competição vem se alterando o tempo todo. A previsão, porém, é de que os antibióticos, as drogas milagrosas do século XX, terminem vencidos pela bactéria, um dos seres mais primitivos na face da Terra. Se isso de fato acontecer, a humanidade fará uma viagem no tempo em marcha ré: voltará a era em que as mulheres morriam de parto por causa de contaminação no sangue, quando uma simples infecção de ouvido infantil podia se transformar numa terrível meningite e pequenos cortes, as vezes, provocavam até complicações fatais. Ninguém imaginaria um cenário tão funesto, há pouco mais de dez anos. No início dos anos 80, a impressão que se tinha era de que, para quase todo mal, havia remédio. Especialmente, em casos de infecções bacterianas, já que triunfavam os antibióticos, medicamentos cujo nome significa "antivida", mas que, na realidade, só agem sobre bactérias. Assim, a ciência médica se declarou vitoriosa e voltou para casa cedo demais, Hoje em dia, não existe absolutamente uma única bactéria que não seja capaz de se desviar, na melhor das hipóteses, de dois antibióticos. Algumas espécies, aliás, já derrotam os mais importantes grupos dessas drogas. Numa experiência recente, cientistas Ingleses misturaram duas espécies de bactérias, a Staphylococcus e a Enterococcus. A primeira era quase imbatível, porque já tinha deixado para trás os mais de 200 tipos de antibióticos conhecidos, com exceção de um deles, a vancomicina. A segunda espécie, por sua vez, sabia o que fazer para derrotar justamente a tal vancomicina - e foi esse segredo que transmitiu para o Staphylococcus aureus, passados alguns dias de convivência em tubo de ensaio. Isso, ocorreu em 1997, em um laboratório da Faculdade de Medicina de Londres, na Inglaterra. Mas não há rastros do estudo, a não ser uma pilha de papéis, relatando o ocorrido. Dois novos antibióticos lançados no Brasil em 2000, o Zyvox e o Synercid, funcionam onde a vancomicina falha. Tomara que por muito tempo.

2 Propagação de bactérias resistentes
matam quase todas as bactérias, mas algumas resistem e ficam activas.... Bactérias resistentes transferem os seus genes resistentes a outro tipo de bactérias.... Antibióticos entram no corpo humano A dessiminação deste problema ocorreu pois a propagação dos microorganismos, neste caso particular, as bactérias dá-se de acordo com o uso generalizado dos antibióticos fez com que as bactérias resistentes passem a existir em todos estes locaus e oproblema da resistencia vem pois . Quando um antibiótico é usado, por exemplo administrado nos humanos, esperava-se que todas as baxtérias que provocam uma determinada patologia fossem susceptiveis ao antibiótico, no entanto o o que ocorre é a resitencia de algumas bactérias ao antibiótico e pior ainda estas bactérias resistentes transmitem esta resistencia, através dos genes resistentes, a outras bactérias da mesma estirpe ou de diferentes estirpes e esta resistencia passa a ser generalizada.

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4 O problema da resistência
Alguns antibióticos e desenvolvimento de resistência Antibiotico Descoberta Uso Clinico Resistência Penicilina 1929 1943 1940 Streptomicina 1944 1947 Tetraciclina 1948 1952 1956 Eritromicina 1955 Vancomicina 1972 1987 Gentamicina 1963 1967 1970 Logo a seguir à descoberta da reistencia à penicilina vários outros antibioticos foram descobertos, mas rapidamente o homem descobriu que a resistência bacteriana é espantosamente engenhosa. As bactérias: Habilidade de mudar a membrana celular para impedir a entrada do antibiótico ou alterar a sua própria composição química para que o antibiótico não as aniquile. Por outro lado, a bactéria pode expulsar o antibiótico com a mesma rapidez com que entrou, ou simplesmente torná-lo inócuo decompondo-o.

5 O problema da resistência
Bactérias mais comuns com resistência múltipla Hospital Comunidade Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecium Mycobacterium tuberculosis Enterococcus faecalis Neisseria gonorrhoeae Klebsiella sp. Streptococcus pyrogenes Enterobacter sp. Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumanii Actualmete varias bactérias são resistentes a vários antibióticos o que torna o problema muito grave, no entanto é preciso ter em conta que a resistência bacteriana é estremamente dependente do meio e como seria de esperar muito pior em termos hospitalares do que na comunidade em geral.

6 O problema da resistência Médico....
Uso profilático antes de uma cirurgia Uso empírico (no known etiologic agent) Aumento do uso de agentes com largo espectro Antibióticos nas rações animais Uso pediátrico para infecções víricas Adesão incompleta à terapêutica Em termos médicos a resitência dessiminasse essencialmente por .....

7 O problema da resistência ANTIBIÓTICOS
Substâncias produzidas por microorganismos que matam ou inibem outros microorganismos Substâncias naturais modificadas no laboratório Substâncias sintetizados no laboratório Neste momento o que é importante é tentar minimizar este problema e para isso como na resolução de qualquer problema é necessário ir à causa... Neste caso é primeiro importante saber O que são os antibióticos? E o que são? São subtâsncia químicas ou Penicilina

8 Várias famílias de antibióticos
17% 3% 3% 37% 14% È importante então entender como estes quatro grandes tipos de mecanismos de resistencia estão relacionados com as diferentes familias de antibióticos isto é efectuado em primeiro lugar para os antibióticos mais utilizados que são.... Peniclinas, cefalosporinas, macrolidos e fluoroquinolonas, então vamos tentar ver se há alguma relação entre a estrutura química e aos mecanismos de resistencia bacteriana 17% 11%

9 Penicilinas Cefalosporinas

10 Macrólidos Fluoroquinolonas

11 Causas de ineficácia Destruição da droga Penicilinas
Famílias de antibióticos mais usadas: Destruição da droga Alteração no receptor Diminuição entrada Mecanismo metabólico alternativo Penicilinas Cefalosporinas Macrólidos Fluoroquinolonas Após sabermos o que é um antibióticos é perceber que estes quer sejam de origem natural ou artificial podem ser agrupada em familias quer pela suas características químicas quer bioquímicas, temos então várias classes de antibióticos que podem ser agrupadas em famílias que advêm essencialmete da sua natureza química e verifica-se também que o seu mecanismo de acção também está relacionada com esta natureza química.... E será que a resistencia também poderá ser explicada com base nestas propriedades químicas e bioquímicas?...... O que sabemos sobre o que acontece aos antibióticos quando não actuam? Estes processos podem também ser agrupados em quatro grandes classes

12 Mecanismo de Acção

13 Mecanismos de Resistência

14 Mecanismos de Resistência
Inactivação da droga S N O R CH3 COOH Penicillin b-lactamase S N O R C-R COOH Cephalosporin E que temos? Enzimas que destroem as peicilinas e as cefalosporinas de esperar para ambas pois anel químico identico são as beta lactamases....

15 Mecanismos de Resistência
Diminuição captura/aumento excrecção Bombas efluxo fluoroquinolonas, b-lactâmicos, macrolidos Redução permeabilidade membrana P. aeruginosa, E. coli O157:H7 quinolonas Bombas de efluxo temos proteínas especificas nas membarnas das bactérias que bomvbeiam determinadas classes de antibióticos para fora da célula: Ocorre tanto para os beta lactamicos como para os macrolidos como para as fluoroquinolonas Redução na permeabilidade da membrana ocorre em bactérias gram(-) em que a passagem de moleculas pequenas ocoore por proteínas diversas que contêm poros e`há modificação do tamanho dos poros que normalmente só foi detectado para fluoroqinolonas e Modificação de transportadores específicos que temos as porinas tanto para betalactamatos como quinolonas. Mutação das porinas Gram (-) b-lactâmicos,quinolonas

16 Mecanismos de Resistência
b-lactâmicos Inactivação da droga Diminuição captura / Aumento excrecção Modificação do alvo Macrólidos Diminuição captura/ aumento excrecção Modificação do alvo Fluoroquinolonas Diminuição captura/aumento excrecção

17 Aumento excrecção Diminuição captura

18 Problema Grave Após introdução do DNA — seja via conjugação, transducção, ou transformação — está incorporado na célula e dá origem a um novo genótipo resistentes

19 Como controlar o problema?
Novas drogas Existem cerca de 100 antibioticos Três mecanismos de acção Farmacêuticas tentam descobrir novas drogas (SAR) Investigação em genética e microbiologia fisiologica, para descobrir novos alvos de acção Ligação a universidades

20 Novos Antibióticos Inibidores da parede celular – baseados no esqueleto dos beta-lactâmicos Novas quinolonas Drogas que inibam os mecanismos de resistência Melhores inibidores das beta-lactamases Bloqueadores das bombas de efluxo Drogas interfiram com as membranas Conhecimento sobre as estrutura/funções membranares aumenta….

21 O que estamos a desenvolver….
Sistemas miméticos que permitam entender as interacções a nível molecular Captura/Uptake antibiótiocs Síntese de possiveis metaloantibióticos: Cu/fluoroquinolona/fenantrolina

22 Activas contra anaerobicos
FLUOROQUINOLONAS NH2 R7 R5 GRAM(-) CH3 GRAM (+) X8 R5 N Nosso estudo inside sobre as fluoroquinolonas hoje mto usadas em todo o tipo de bacterias e a sua acção advem de pequenas variações químicas…, o que tentamos faze é entender a nível molecular o mecanismo de ação atravé das proteínad de membrana tipicas para a entrada destes antibióticos. O-CH3 Activas contra anaerobicos X8 X8 N

23 Proteínas da membrana externa Diminuição da captura
Responsáveis pela captura de fluoroquinolonas Porinas Proteínas que formam poros OmpF a mais estudada Trimero muito estável Estas são denominadas porinas fromam poros e sendo a amis usual a OMPf mais mais amais….. Dados clínicos comprovam que diminuição do influxo/captura causa de resistência

24 O que se verifica a nível clínico….

25 Preparação dos sistemas miméticos
Lipossomas T>Tm lípido MLV LUV DMPC

26 Proteoliposomes: reconstitution
Diluição fitração por gel Biobeads: Detergent beads Remoção surfactante Detergent Reconstitution mixture Mixed micelles Reconstitution mixture Proteoliposomes adsortion proteoliposomes

27 Proteolipossomas verificão da insertção
DPH TMA-DPH x x Estudos anisotropia AFM DPH Tm = 24.40.3 ºC. Tm = 23.60.1 ºC. Bicamada achatada e homogénea, mostra inserção da porina (i.e. globular features of 1.8 ± 0.7nm in height), Liposomes Proteoliposomes biobeds Proteoliposomes column Proteoliposomes sonication

28 Espectro de actividade antibacteriana
Como escolher o sistema…. Espectro de actividade antibacteriana

29 Testes susceptibilidade (cmc)
Estirpes bacterianas BL21(DE3) mae (OmpF:Tn5) 2 (∆ lambB ∆ OmpC) 6 (∆ lambB OmpF:Tn5 ∆ OmpC) 7 BL21(DE3), no porin 8 Testes susceptibilidade (cmc)

30 OMPF: proteína mais importante
24 Å DMPC 23 Å

31 Interacção de fluoroquinolonas:
Ciprofloxacin E.Coli Modelos

32 Resultados Interação Quinolonas/OmpF : Constantes Associação (OmpF/QN)
Conatantes de associação indicam a afinidade do ligando para a proteína Importancia da OmpF na captura das quinolonas em bacterias Gram (-) Desvio espectral indica interacção Espectroscopia de UV-vis e de Fluorescencia Log K Nalixic Ac Ciprofl Enrofl Moxiflo DMPC 3.98 ± 0.04 4.22 ± 0.07 4.40 ± 0.07 4.45 ± 0.10 Há aumento da afinidade para a proteína das fluoroquinolonas mais recentes Interaction between quinolones antibiotics and bacterial outer membrane porin OmpF, Patrícia Neves, Emir Berkane, Paula Gameiro, Mathias Winterhalter, Baltazar de Castro. Biophys. Chem. 2005, 113,

33 LOCALIZAÇÃO

34 Localização das drogas no proteolipossoma
DMPC Nalidixic Ciproflo Enroflo Moxiflo Ka fa I- 2.8 0.4 1.5 0.5 2.2 0.7 3.1 (±0.2) (±0.1) (±0.3) Acryl 3.8 0.6 3.5 1.9 5.1 AN decresce Ka  Interação na interface lipido/OmpF I- CP interactua muito pouco com Trp214 Enr diminui Ka  Interação na interface lipido/OmpF MX ⇨ aumento de Ka possivel alteração na conformação ACR AN, CP não provocam qualquer alteração Enr diminui Ka  interacção perto do Trp61 MX comportamento diferente ⇨ possivel interacção perto do Trp61 Fluorescence Quenching as a Tool to Investigate Quinolone Antibiotic Interactions with Bacterial Protein OmpF P. Neves,I Sousa, Ma. Winterhalter, P. Gameiro. J. Memb.Biol. 2009, 227, 133–140

35 Antes adição antibiótico
Localização da droga Estudos de conductância 5 mM acido nalidixico Antes adição antibiótico 5 mM moxifloxacina Corrobora as conclusões para o ácido nalidixico

36 Moxifloxacin interactua mais perto do Trp61
Localização da droga Estudos de dinâmica molecular Verifica-se a chegada da moxifloxacina ao local de ligação e um alargamento do poro. Este indica um rearranjo da conformação da proteína para acomo dar a moxifloxacina. Moxifloxacin interactua mais perto do Trp61 Facilitated permeation of antibiotics across membrane channels – interaction of the quinolone moxifloxacin with the OmpF channel”, T. Mach, P. Neves, E. Spiga, H. Weingart, M.s Winterhalter, P. Ruggerone, M.Ceccarelli, P.Gameiro J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (40), 13301–13309.

37 Localização da droga Enrofloxacina
Estudos de condutância e dinâmica molecular corroboram os resultados de fluorescência: droga perto dos dois Trp “Molecular Basis of Enrofloxacin Translocation through a Bacterial Porin – When Binding does not Imply Translocation “. Hajjar, E.; Mach, Ti.; Lovelle, M.; Sousa, I.; Kumar, A.t; Weingart, H.; Gameiro, P.; Winterhalter, M.; Ceccarelli, M.; Spiga, E.; Kozhinjampara, M.. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 5170–5179

38 Estudos com mutantes na zona de constrição
Mutantes testados OmpF R132A OmpF D113N A substituição de um resíduo R132A (+) não parece afectar a velocidade de translocação Mas a substituição de D113N (-) resulta num aumento da velocidade de translocação

39 Sem antibiotico Com ENRO OmpF padrão Ka (M-1) fa acrilamida 3.8 (±0.2) 0.6 (±0.2) 1.9 (±0.3) 0.7 (±0.1) I - 2.8 (±0.4) 0.4 (±0.2) 0.4 (±0.1) D113N 2.4 (±0.1) 0.8 (±0.2) 1.7 (±0.3) 2.7 (±0.5) 0.2 (±0.2) 11.7 (±1.9) 0.2 (±0.1) R132A 2.6 (±0.1) 1.8 (±0.3) 12.9 (±0.5) 0.5 (±0.2) 11.5 (±1.9) Enro na estirpe padrão localizada em ambos oe Trp. No D113N a Enr está localizada dentro do canal e tranlocação muito mias rapida que na estirpe padrão MUTAÇÃO DE RESIDUO NEGATIVO MUDA A AFINIDADE DROGA/PORINA E A VELOCIDADE DE TRANSLOCAÇÃO.

40 O que tentamos conseguir:
Métodos permitem a identificação de resíduos específicos de aa que estão localizados no canal e têm um papel muito importante na captura das fluoroquinolonas Entender a passagem através das porinas e permitir o “desenho” racional de novos antibióticos mais eficazes e que consigam contornar os mecanismos de resistência Sintese de derivados destes antibióticos ????

41 Tentar minimizar resistência
RESISTENCE TO FLUOROQUINOLONES Síntese de derivados destes antibióticos Tentar minimizar resistência Fluoroquinolonas hidrofóbicas Complexos de metais de transição Complexos binários Complexos ternários Although all fluoroquinolones are active, to same extent, against these enzymes, mutations in both enzymes occurs in a stepwise selection for resistance and promoting higher levels of resistence. In the determination of fluoroquinoles resistance another important factor is the expression or overexpression of energy-dependent efflux pumps that can actively remove antibacterial agents from cell. The existence of transition metal ions or the use of complexes of fluoroquinolones with metal ions can also be very important to achieve lower level of resistance As an attempt to clarify the role of transition metals and how they exert their action on biological systems, the coordination behavior of the systems Cu(II)/norfloxacin and Cu(II)/ofloxacin, in aqueous solution, has been studied Acido nalidixico/Cu/fenantrolina Nuclease química

42 Complexos binários Cu2+ + HL [CuHL]2+ Cu2+ + 2HL [Cu(HL)2]2+
Cu2+ + HL [CuL]+ + H+ Cu2+ + 2HL [CuL2]2+ + 2H+ log 110 log 120 Cu(II)/OFLO 6.240.04 11.200.04 Cu(II)/NORFLO 6.950.03 12.700.04

43 Complexos muito estáveis
Complexos ternários Cu2+ + HL + A  CuHLA Cu2+ + L + A  CuLA CuHLA CuLA CIP 17.96 17.37 ENR 16.54 16.93 MOX 15.97 Complexos muito estáveis

44 Complexo com estrutura raio X
[CuLA]+ Solução a pH 7.4 [CuHLA] [CuLA]+

45 Complexos ternários derivatives Enro CuENRA Mox CuMOXA POPE/POPG
270±23 551.3 316±42 299±62 POPE/POPG/CL 167±32 843.2 243±41 435±12 E. coli total 159±17 1282.9 258±23 1013±12 MIC (M) 4.00x10-3 4.20x10-3 3.80x10-3 2.30x10-3 MIC (M)/no OMPF 8.80x10-3 14.0x10-3 2.74x10-3 1.48x10-3

46 Complexos ternários .AFM.. Usado para complementar o estudos do complexo ternário em diferentes estirpes de E.Coli e permite verificar variações morfologicas BL21(DE3) untreated BL21(DE3) treated with ternary complex BL21(DE3)omp8 treated with ternary complex

47 Estudos em bactérias resistentes
promissor em Gram (+)…

48 Conclusões Entender o mecanismo de acção a nível molecular
Modelos miméticos com boa inserção da proteína. Usar mais do que uma técnica . Modelação molecular, conductância, AFM e fluorescência complementam-se Complexos ternários parecem promissores .

49 Agradecimentos IST, Lisboa Manuel Prieto Fabio Luis Loura
Jacobs University Bremen Mathias Winterhalter Helge Weingart Mahendran Kozhinjampa Università di Cagliari Paolo Ruggerone Mateo Ceccarelli Eric Hajjar Requimte, FCUP Mª José Feio Peter Eaton Sílvia Lopes Isabel Sousa Patrícia Neves Marcos Lovelle Tivadar Mach Raúl Saraiva Mariana Ferreira Carla Ribeiro IHMT/UNL Sofia Santos Costa Isabel Couto Miguel Viveiros €€€€ Fundação para a Ciência e Tecnologia PTDC/SAL-FAR/111414/2009 €€€€ EU- MRTN-CT-2005– (Translocation) €€€€ REQUIMTE

50 Obrigada

51 http://www.rivm.nl/earss/ (The European Antimicrobial Resistance Surveillance System )


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