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Paula Gameiro Resistência Bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica )

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Apresentação em tema: "Paula Gameiro Resistência Bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica )"— Transcrição da apresentação:

1 Paula Gameiro Resistência Bacteriana (na busca de novos antibióticos – um trabalho de cooperação entre Biofísica, Microbiologia e Síntese Inorgânica ) uso generalizado e maciço de antibióticos e acontece quer estes sejam usados para tratar infecções, quer como profilaxia ou como promotores do crescimento animal

2 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Antibióticos entram no corpo humano matam quase todas as bactérias, mas algumas resistem e ficam activas.... Bactérias resistentes transferem os seus genes resistentes a outro tipo de bactérias.... Propagação de bactérias resistentes

3 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina

4 O problema da resistência Alguns antibióticos e desenvolvimento de resistência AntibioticoDescobertaUso ClinicoResistência Penicilina Streptomicina Tetraciclina Eritromicina Vancomicina Gentamicina

5 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O problema da resistência Bactérias mais comuns com resistência múltipla HospitalComunidade Staphylococcus aureusStreptococcus pneumoniae Enterococcus faeciumMycobacterium tuberculosis Enterococcus faecalisNeisseria gonorrhoeae Klebsiella sp.Streptococcus pyrogenes Enterobacter sp.Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumanii

6 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O problema da resistência Médico....  Uso profilático antes de uma cirurgia  Uso empírico (no known etiologic agent)  Aumento do uso de agentes com largo espectro  Antibióticos nas rações animais  Uso pediátrico para infecções víricas  Adesão incompleta à terapêutica

7 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O problema da resistência ANTIBIÓTICOS  Substâncias produzidas por microorganismos que matam ou inibem outros microorganismos  Substâncias naturais modificadas no laboratório  Substâncias sintetizados no laboratório Penicilina

8 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina 37% Várias famílias de antibióticos 17% 11% 14% 17% 3%

9 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina PenicilinasCefalosporinas

10 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina FluoroquinolonasMacrólidos

11 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Causas de ineficácia Famílias de antibióticos mais usadas:  Penicilinas  Cefalosporinas  Macrólidos  Fluoroquinolonas  Destruição  Destruição da droga  Alteração  Alteração no receptor  Diminuição  Diminuição entrada  Mecanismo  Mecanismo metabólico alternativo

12 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Mecanismo de Acção

13 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Mecanismos de Resistência

14 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Inactivação da droga Mecanismos de Resistência S N O NR CH 3 COOH Penicillin S N O NR C-R COOH Cephalosporin  -lactamase

15 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Diminuição captura/aumento excrecção Mecanismos de Resistência  Bombas efluxo fluoroquinolonas, fluoroquinolonas,  -lactâmicos, macrolidos  -lactâmicos, macrolidos  Redução permeabilidade membrana P. aeruginosa, E. coli O157:H7 P. aeruginosa, E. coli O157:H7 quinolonas quinolonas  Mutação das porinas Gram (-) Gram (-)  -lactâmicos,quinolonas  -lactâmicos,quinolonas

16 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Mecanismos de Resistência InactivaçãoInactivação da droga Inactivação DiminuiçãoDiminuição captura / Diminuição ModificaçãoModificação do alvo Modificação  -lactâmicos  -lactâmicos Macrólidos Fluoroquinolonas Diminuição captura/ Modificação Modificação do alvo Modificação Diminuição Diminuição captura/aumento excrecção Diminuição AumentoAumento excrecção Aumento aumentoaumento excrecção aumento

17 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Diminuição captura Aumento excrecção

18 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Problema Grave Após introdução do DNA — seja via conjugação, transducção, ou transformação — está incorporado na célula e dá origem a um novo genótipo resistentes

19 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Como controlar o problema?  Novas drogas Existem cerca de 100 antibioticos Existem cerca de 100 antibioticos Três mecanismos de acção Três mecanismos de acção Farmacêuticas tentam descobrir novas drogas (SAR) Farmacêuticas tentam descobrir novas drogas (SAR) Investigação em genética e microbiologia fisiologica, para descobrir novos alvos de acção Investigação em genética e microbiologia fisiologica, para descobrir novos alvos de acção Ligação a universidades Ligação a universidades

20 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Novos Antibióticos  Inibidores da parede celular – baseados no esqueleto dos beta-lactâmicos  Novas quinolonas  Drogas que inibam os mecanismos de resistência Melhores inibidores das beta-lactamases Melhores inibidores das beta-lactamases Bloqueadores das bombas de efluxo Bloqueadores das bombas de efluxo  Drogas interfiram com as membranas Conhecimento sobre as estrutura/funções membranares aumenta…. Conhecimento sobre as estrutura/funções membranares aumenta….

21 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O que estamos a desenvolver….  Sistemas miméticos que permitam entender as interacções a nível molecular Captura/Uptake antibiótiocs Captura/Uptake antibiótiocs  Síntese de possiveis metaloantibióticos: Cu/fluoroquinolona/fenantrolina

22 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina FLUOROQUINOLONAS NH 2 R7R5R7R5 GRAM(-) CH 3 GRAM (+) X8R5X8R5 N O-CH 3 Activas contra anaerobicos X8X8X8X8 N

23 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Proteínas da membrana externa Diminuição da captura Proteínas que formam poros OmpF a mais estudada Trimero muito estável Responsáveis pela captura de fluoroquinolonas Porinas Dados clínicos comprovam que diminuição do influxo/captura causa de resistência

24 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O que se verifica a nível clínico….

25 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Preparação dos sistemas miméticos Lipossomas T>T m lípido MLV LUV DMPC

26 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Proteoliposomes: reconstitution fitração por gelDiluição Biobeads: Detergent beads Reconstitution mixture adsortion Proteoliposomes Reconstitution mixture Detergent Mixed micelles proteoliposomes Remoção surfactante

27 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Estudos anisotropia DPH Liposomes Proteoliposomes biobeds Proteoliposomes column Proteoliposomes sonication T m = 24.4  0.3 ºC. T m = 23.6  0.1 ºC. DPH TMA-DPH x x AFM Bicamada achatada e homogénea, mostra inserção da porina (i.e. globular features of 1.8 ± 0.7nm in height), Proteolipossomas verificão da insertção

28 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Espectro de actividade antibacteriana Como escolher o sistema….

29 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Estirpes bacterianas Testes susceptibilidade (cmc) BL21(DE3) mae (OmpF:Tn5) 2 (∆ lambB ∆ OmpC) 6 (∆ lambB OmpF:Tn5 ∆ OmpC) 7 BL21(DE3), no porin 8

30 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina 24 Å 23 Å DMPC OMPF: proteína mais importante

31 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Interacção de fluoroquinolonas: Modelos Ciprofloxacin E.Coli

32 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Resultados Interação Quinolonas/OmpF : Constantes Associação (OmpF/QN) Importancia da OmpF na captura das quinolonas em bacterias Gram (-) afinidade Conatantes de associação indicam a afinidade do ligando para a proteína Espectroscopia de UV-vis e de Fluorescencia Desvio espectral indica interacção Log K Nalixic AcCiproflEnroflMoxiflo DMPC 3.98 ± ± ± ± 0.10 Há aumento da afinidade para a proteína das fluoroquinolonas mais recentes Interaction between quinolones antibiotics and bacterial outer membrane porin OmpF, Patrícia Neves, Emir Berkane, Paula Gameiro, Mathias Winterhalter, Baltazar de Castro. Biophys. Chem. 2005, 113,

33 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina LOCALIZAÇÃO

34 Localização das drogas no proteolipossoma DMPCNalidixicCiprofloEnrofloMoxiflo KaKa fafa KaKa fafa KaKa fafa KaKa fafa KaKa fafa I-I (±0.2)(±0.1)(±0.3)(±0.1) (±0.2)(±0.1) Acryl (±0.1) (±0.2)(±0.1) (±0.3)(±0.1) MX ⇨ aumento de K a possivel alteração na conformação MX comportamento diferente ⇨ possivel interacção perto do Trp 61 I-I- ACR AN decresce K a  Interação na interface lipido/OmpF CP interactua muito pouco com Trp 214 Enr diminui K a  Interação na interface lipido/OmpF AN, CP não provocam qualquer alteração Enr diminui K a  interacção perto do Trp 61 Fluorescence Quenching as a Tool to Investigate Quinolone Antibiotic Interactions with Bacterial Protein OmpF P. Neves,I Sousa, Ma. Winterhalter, P. Gameiro. J. Memb.Biol. 2009, 227, 133–140

35 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Localização da droga 5 mM acido nalidixico Antes adição antibiótico 5 mM moxifloxacina Corrobora as conclusões para o ácido nalidixico Estudos de conductância

36 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Estudos de dinâmica molecular Verifica-se a chegada da moxifloxacina ao local de ligação e um alargamento do poro. Este indica um rearranjo da conformação da proteína para acomo dar a moxifloxacina. Moxifloxacin interactua mais perto do Trp61 Facilitated permeation of antibiotics across membrane channels – interaction of the quinolone moxifloxacin with the OmpF channel”, T. Mach, P. Neves, E. Spiga, H. Weingart, M.s Winterhalter, P. Ruggerone, M.Ceccarelli, P.Gameiro J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (40), 13301– Localização da droga

37 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Enrofloxacina “Molecular Basis of Enrofloxacin Translocation through a Bacterial Porin – When Binding does not Imply Translocation “. Hajjar, E.; Mach, Ti.; Lovelle, M.; Sousa, I.; Kumar, A.t; Weingart, H.; Gameiro, P.; Winterhalter, M.; Ceccarelli, M.; Spiga, E.; Kozhinjampara, M.. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 5170–5179 Localização da droga Estudos de condutância e dinâmica molecular corroboram os resultados de fluorescência: droga perto dos dois Trp

38 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Mutantes testados OmpF R132A OmpF D113N A substituição de um resíduo R132A (+) não parece afectar a velocidade de translocação Mas a substituição de D113N (-) resulta num aumento da velocidade de translocação Estudos com mutantes na zona de constrição

39 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Sem antibiotico Com ENRO OmpF padrãoK a (M -1 )fafa fafa acrilamida3.8 (±0.2)0.6 (±0.2)1.9 (±0.3)0.7 (±0.1) I -I (±0.4)0.4 (±0.2)0.4 (±0.1)0.7 (±0.1) D113NK a (M -1 )fafa fafa acrilamida2.4 (±0.1)0.8 (±0.2)1.7 (±0.3)0.7 (±0.1) I (±0.5)0.2 (±0.2)11.7 (±1.9)0.2 (±0.1) R132AK a (M -1 )fafa fafa acrilamida2.6 (±0.1)0.6 (±0.2)1.8 (±0.3)0.6 (±0.2) I (±0.5)0.5 (±0.2)11.5 (±1.9)0.5 (±0.2) MUTAÇÃO DE RESIDUO NEGATIVO MUDA A AFINIDADE DROGA/PORINA E A VELOCIDADE DE TRANSLOCAÇÃO. Enro na estirpe padrão localizada em ambos oe Trp. No D113N a Enr está localizada dentro do canal e tranlocação muito mias rapida que na estirpe padrão

40 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina O que tentamos conseguir:  Métodos permitem a identificação de resíduos específicos de aa que estão localizados no canal e têm um papel muito importante na captura das fluoroquinolonas  Entender a passagem através das porinas e permitir o “desenho” racional de novos antibióticos mais eficazes e que consigam contornar os mecanismos de resistência  Sintese de derivados destes antibióticos ????

41 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina RESISTENCE TO FLUOROQUINOLONES Tentar minimizar resistência Fluoroquinolonas hidrofóbicas Complexos de metais de transição Complexos binários Complexos ternários Acido nalidixico/Cu/fenantrolina Nuclease química Síntese de derivados destes antibióticos

42 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina log  110 log  120 Cu(II)/OFLO 6.24   0.04 Cu(II)/NORFLO 6.95   0.04 Complexos binários Cu 2+ + HL [CuHL] 2+ Cu HL [Cu(HL) 2 ] 2+ Cu 2+ + HL [CuL] + + H + Cu HL [CuL 2 ] H +

43 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Complexos ternários Cu 2+ + HL + A  CuHLA Cu 2+ + L + A  CuLA CuHLACuLA CIP ENR MOX Complexos muito estáveis

44 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Complexo com estrutura raio X [CuLA] + Solução a pH 7.4 [CuHLA] 2+ [CuLA] +

45 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Complexos ternários EnroCuENRAMoxCuMOXA POPE/POPG270± ±42299±62 POPE/POPG/CL167± ±41435±12 E. coli total159± ±231013±12 MIC (  M) 4.00x x x x10 -3 MIC (  M)/no OMPF 8.80x x x x10 -3 derivatives

46 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina BL21(DE3 ) untreatedBL21(DE3) treated with ternary complex BL21(DE3)omp8 treated with ternary complex.AFM.. Usado para complementar o estudos do complexo ternário em diferentes estirpes de E.Coli e permite verificar variações morfologicas Complexos ternários

47 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensina Estudos em bactérias resistentes promissor em Gram (+)…

48 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensinaConclusões  Entender o mecanismo de acção a nível molecular  Modelos miméticos com boa inserção da proteína.  Usar mais do que uma técnica.  Modelação molecular, conductância, AFM e fluorescência complementam-se  Complexos ternários parecem promissores.

49 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensinaAgradecimentos Jacobs University Bremen Mathias Winterhalter Helge Weingart Mahendran Kozhinjampa Università di Cagliari Paolo Ruggerone Mateo Ceccarelli Eric Hajjar IST, Lisboa Manuel Prieto Fabio Luis Loura Requimte, FCUP Mª José Feio Peter Eaton Sílvia Lopes Isabel Sousa Patrícia Neves Marcos Lovelle Tivadar Mach Raúl Saraiva Mariana Ferreira Carla Ribeiro €€€€ Fundação para a Ciência e Tecnologia PTDC/SAL-FAR/111414/2009 €€€€ EU- MRTN-CT-2005– (Translocation) €€€€ REQUIMTE IHMT/UNL Sofia Santos Costa Isabel Couto Miguel Viveiros

50 A CIÊNCIA por quem a faz e por quem a ensinaObrigada

51  (The European Antimicrobial Resistance Surveillance System )  NFARMED NFARMED NFARMED


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