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Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas.

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1 Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios Laboratório Central - HSP - UNIFESP

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3 O Anel  -lactâmico Sítio de ação da  -lactamase GRUPOS: èPenicilina èCefalosporinas èMonobactâmicos: aztreonam èCarbapenêmicos: imipenem meropenem ertapenem Beta Lactâmicos

4 1 a Geração Cefazolin Cefamandol Cefonicid Cefotetan Cefoxitina Cefuroxima Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona CefepimaCefalosporinas 4 a Geração 2 a Geração 3 a Geração

5 RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS Natural ou intrínseca ou Constitutiva Aeróbios AnaeróbiosAminoglicosídeos Adquirida Cromossômica Mutação de genes Resistência única- não é transmitida de célula para célula a menos que o gene esteja em integron Plasmidial TransmissívelResistência múltipla Produção: ß- lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases. Metronidazol

6 Evolução Clínica Microrganismo Antimicrobiano Paciente Teste de sensibilidade ImunidadeFarmacologia

7 Reprodução da descoberta de Fleming Reprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos

8 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS METODOLOGIAS METODOLOGIAS Avaliação QUALITATIVA  DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Avaliação QUANTITATIVA  DILUIÇÃO EM CALDO Macrodiluição Macrodiluição Microdiluição Microdiluição  DILUIÇÃO EM ÁGAR  AUTOMATIZADOS  ETEST

9 MACRODILUIÇÃO controle  g/mL ò Conceito ò Precisão ò Vantagens ò Desvantagens Método quantitativo  MIC

10 MACRODILUIÇÃO EM CALDO

11 Determinação do MICMIC É a menor concentração inibitória mínima que inibe completamente o crescimento bacteriano  g/mL

12 MACRODILUIÇÃO MBC  g/mL MIC controle

13 MICRODILUIÇÃO

14 TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR  Utilizado rotineiramente  Fácil execução  Flexibilidade na escolha dos antibióticos  Reprodutibilidade nos resultados  Padronização dos resultados  Baixo custo

15 TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Princípio do método

16 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação mm

17 DILUIÇÃO EM ÁGAR  Utilizado em estudos epidemiológicos  Fácil execução  Permite testar vários isolados simultaneamente  Promove resultados quantitativos  Permite o teste de bactérias fastidiosas  Baixo custo (relativo) Poucos isolados Poucos isolados  Preparo das placas e estocagem

18 DILUIÇÃO EM ÁGAR Ágar com 6  g/mL de Vancomicina Enterococcus spp. S   4  g/mL I  8-16  g/mL R   32  g/mL

19 Diluição em Ágar - Desvantagens äMuito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados äAs placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo Helio Sader - LEMC

20 Princípio do método Etest

21 Etest®  Difusão

22 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Curva de regressão

23 Relação entre o MIC, Zona de inibição e “Breakpoints”.

24 MIC  DIFUSÃO controle mm  g/mL

25 Interpretação do Etest

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28 NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS CLSI - antigo“NCCLS” Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomissão do CLSI é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

29  Processos Padronizados (POPs)  Controle de qualidade dos itens: meios (efeito timidina ou timina) pH temperatura incubação discos (ATCCs) fitas de Etest TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS Padronização

30 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Bactéria e Preparo do Inóculo ò Suspensão direta ò Método de crescimento 0,5 McFarland 1a 2x10 8 UFC/mL 0,5 McFarland 1a 2x10 8 UFC/mL

31 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Bactéria e Inóculo Bactéria recentemente isolada Colônias bem isoladas

32 CRESCIMENTO BACTERIANO

33 TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR MEIOS 1- Ágar Mueller-Hinton 2- Ágar Mueller-Hinton suplementado 3- Ágar GC 3- Haemophilus Test Medium (HTM)

34  Reprodutibilidade do teste.  Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas.  Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenos.  Grande número de dados e experiência com o meio. MEIO MUELLER- HINTON TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR

35 O que devemos saber sobre os meios?  Hidratar e autoclavar  60 a 70 mL 150 mm 25 a 30 mL 90 mm 25 a 30 mL 90 mm  pH 7.2 a 7.4  Conservação 2 a 8 o C  Teste de esterilidade 4 mm

36 TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR  Umidade  Efeito da Timidina ou Timina Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim. Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim.  Conservação 2 a 8 o C  Teste de esterilidade  Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio O que devemos saber sobre os meios?

37 TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Discos  Conservação8 o C ou  freezer (não “frost free”) Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico  Retirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso  Evitar umidade  Data de validade

38 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos  Laboratório Clínico  Infectologistas  Comissão de Infecção Hospitalar  Comissão de Controle de Antimicrobianos  Farmácia Seleção dos antibióticos

39  Isolado requer terapia antimicrobiana  Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva  Isolado capaz de exibir resistência  Orientação terapêutica  Permite individualizar padrões de resistência Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Quando e porquê realizar o antibiograma?

40 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Métodos: Métodos:  Crescimento  Suspensão direta Inóculo

41 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo - Método do crescimento  3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB  Incubar a 35 o C -  Incubar a 35 o C - (2 a 6h)  Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 0,5 McFarland 1a 2x10 8 UFC/mL 1a 2x10 8 UFC/mL

42 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo - Suspensão direta  3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB ou salina  Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1 a 2 x 10 8 UFC/mL 1 a 2 x 10 8 UFC/mL  Estabilizar 15 min.

43 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inóculo

44 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação

45 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação  Superfície do ágar não deve estar úmida  Inoculação homogênea  Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos

46 Aplicação dos discos Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento  Bateria pré determinada  Aplicar e pressionar o disco  Aplicar no máximo 12 discos na placa de 150mm 5 discos na placa de 90mm 5 discos na placa de 90mm  Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação

47 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Incubação  Temperatura 35 o C  Atmosfera atm ambiente exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos CO 2 CO 2

48 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação

49 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O que testar? Como interpretar? Como interpretar?

50 “CLSI-2005 ” Quais são os antibióticos devemos utilizar? Grupo A:1ª escolha - testados e reportados Grupo B:1ª escolha - testados e reportados seletivamente Grupo C:suplementares e reportados seletivamente Grupo U:testados em isolados de urina Grupo O:outros não rotineiramente utilizados Grupo inv:em investigação A lista de cada microrganismo compreende agentes de eficácia comprovada e que tem um comportamento aceitável nas provas in vitro.

51 ò Recomendações na escolha dos antimicrobianos ò Padronização das técnicas ò Critérios para a interpretação dos resultados ò Parâmetros para o controle qualidade do teste. “CLSI”

52 Interpretação do Resultado Susceptível (S) A categoria susceptível implica que a infecção causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso. Desde que não haja contra indicação.

53 Interpretação do Resultado Intermediária (I) A categoria intermediária inclui isolados cujos MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas.

54 Interpretação do Resultado Resistente (R) A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expressado.

55  Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro  Inóculo  suspensão direta, 0,5 McFarland  Incubação  35 o C ± 2 o em atm. 5% CO 2  Leitura  20 a 24h  Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* CLSI, M100-S15, 2005 Avaliação da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae

56  Escolha dos discos  Tabela 2G Oxacilina  Penicilina não recomendado para outros estreptococos  Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G)  Interpretação Oxacilina  20 mm  Sensível  19 mm penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima MIC CLSI, M100-S15, 2005

57 Streptococcus pneumoniae CLORANFENICOL3 ERITROMICINA1 OFLOXACINA OXACILINA 1  g  PENICILINA 1 RIFAMPICINA 3 GATIFLOXACINA3 SULFA/TRIMET1 VANCOMICINA2 Ampicilina, Amoxacilina, amoxacilina/ác.clav. ampicilina/sulb., cefaclor, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona, cefuroxima, imipenem e meropenem Penicilina Meropenem Ceftriaxona  20mm S < 17 mm LevofloxacinaMoxifloxacina CLSI, M100-S15, 2005 AzitromicinaClaritromicina  19 mm MIC

58 Avaliação da Sensibilidade Streptococcus spp.  Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro  Inóculo  suspensão direta  Incubação  35 o C ± 2 o em atm. 5% CO 2  Leitura  20 a 24h  Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* CLSI, M100-S15, 2005

59 Avaliação da Sensibilidade - Enterococos  Ágar Mueller-Hinton  Inóculo  crescimento ou suspensão direta  Incubação  35 o C ± 2 o em atm. ambiente  Leitura  16 a 18h, 24h para Vancomicina  R 24h para Vancomicina  R MIC CLSI, M100-S15, 2005

60 Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) 1º Isolado final dos anos anos após Vancomicina > 20% das infecções pelo Enterococo

61 Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) Resistência Intrínseca äEnterococcus gallinarum e E. casseliflavus Resistência adquirida äEnterococcus faecium e E. faecalis

62 Detecção do pigmento - Enterococcus spp. Pigmento amareloSimMotilidade 30ºCNegativo E. mundii Positivo E. casseliflavus BHIA E. faecium E. faecalis E. gallinarum

63 AMPICILINA1 CIPROFLOXACINA U CLORANFENICOL3 GENTAMICINA 120  g 3 STREPTOMICINA 300  g 3 TEICOPLANINA VANCOMICINA2 QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN2 Penicilina Sinergismo positivo Sinergismo negativo Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav., ampicilina/sulbactan, piperacilina e piperacilina/tazobactan. Para cepas não produtoras de  lactamases Detecção de  lactamases + R  Penicilina S mm  MIC 7-9 mm  MIC Avaliação da sensibilidade dos Enterococcus spp. E. faecalis ATTC ® CLSI.M100 -S15, 2005 Imipenem E. faecalis S 24 h de incubação

64 VRE + –

65 Avaliação da Sensibilidade Estafilococos  Ágar Mueller-Hinton  Inóculo  suspensão direta  Incubação  33 a 35 o C em atm. ambiente  Leitura  16 a 18 24h  Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina 24h  Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina MRSA e MRS CLSI, S15, 2005

66 CIPROFLOXACINA3 CLINDAMICINA2 ERITROMICINA2 GENTAMICINA3 OXACILINA 1  g 1 CEFOXITINA PENICILINA1 SULFA/TRIMET2 TEICOPLANINA VANCOMICINA2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA3 Staphylococcus aureus Azitromicina Claritromicina Rotineiramente não são reportado em urina MRSA CIPROFLOXACINA3 CLINDAMICINA2 ERITROMICINA2 GENTAMICINA3 OXACILINA 1  g 1 CEFOXITINA PENICILINA1 SULFA/TRIMET2 TEICOPLANINA VANCOMICINA2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA3 MRS As penicilinas, cefens e outros  lactâmicos como amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav. e carbapenems Oxa R  PR Oxa s e PS  S <14mm  MIC LevofloxacinaOfloxacina Oxa s e PR   lactamase Gene mec A CLSI, S15, 2005 Staphylococcus não aureus

67 NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS “NCCLS” LABORATORY STANDARDS “NCCLS” Vancomicina  halo  14 mm MIC Incubação por 24horas a 33 a 35°C  MIC  4  g Encaminhar a Laboratório de Referência Laboratório de Referência Staphylococcus spp.

68 Detecção do VISA e VRSA Diluição em ágar BHIA 6  g/mL Vancomicina

69 Detecção do VISA e VRSA E-test

70 Avaliação da Sensibilidade Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cepacia  Ágar Mueller-Hinton  Inóculo  método do crescimento ou suspensão direta  Incubação  35 o C ± 2 o em atm. ambiente  Leitura  16 a 18h  Controle de qualidade  P. aeruginosa ATTC*  E. coli ATTC*  E. coli ATTC* S. maltophilia e B. cepacia  20 a 24 horas P. aeruginosa na Fibrose cística CLSI.M100 -S15, 2005

71 Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. AMICACINA 2 TOBRAMICINA 2 GENTAMICINA 1 CEFEPIMA2 CEFTAZIDIMA1 CIPROFLOXACINA2 IMIPENEM2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA1 TICARCICINA1 PIPE/TazoO TICARC/ Ác.clav.O POLIMIXINA POLIMIXINA AMICACINA2 GENTAMICINA1 AMPICILINA/Subac. CEFEPIMA2 CEFTAZIDIMA1 CEFTRIAXONA3 CIPROFLOXACINA 2 IMIPENEM2 MEROPENEM2 PIPERACILINA1 TICARCICINA1 PIPE/TazoO TICARC/ Ác.clav.O POLIMIXINA Cefotaxima Pode ser reportado quando a cepa for resistente CLSI,M100 -S15, 2005 Levofloxacina

72 Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia cepacia CEFTAZIDIMA 1 MEROPENEM2 MINOCICLINA0 TRIMETOPRIM - SULFAMETOXAZOL3 LEVOFLOXACINA2 MINOCICLINA0 TRIMETOPRIM - SULFAMETOXAZOL3 CLSI.M100 -S15, 2005

73 Avaliação da Sensibilidade Enterobactérias  Ágar Mueller-Hinton  Inóculo  método de crescimento e suspensão direta  Incubação  35 o C ± 2 o em atm. ambiente  Leitura  16 a 18h  Controle de qualidade  E. coli ATTC*  E. coli ATTC* NCCLS.M100 -S15, 2005

74 Enterobactérias AMICACINA2 AMPICILINA1 AMPICILINA/Sulbactan2 AZTREONAM3 CEFALOTINA1 CEFEPIMA2 CEFTAZIDIME3 CEFOXITINA2 CEFTRIAXONA2 CIPROFLOXACINA2 GENTAMICINA1 IMIPENEM2 ERTAPENEM2 PIPERACILINA/Tazobactan2 SULFA/TRIMET2 TICARCILINA/Äc.clavulânico2 Cefotaxima Meropenem Levofloxacina Amoxacilina Amoxacilina/ác.clavulânico CLSI.M100 -S15, 2005

75 Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp  Ágar Haemophilus Test Medium (HTM)  Inóculo  suspensão direta  Incubação  35 o C em atm. 5% CO 2  Leitura  16 a 18h  Controle de qualidade  H. influenzae ATTC*  H. influenzae ATTC*  H. influenzae ATTC*  E. coli ATTC*  E. coli ATTC* NCCLS.M100 -S15, 2005

76 Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp + – O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina  Ágar Haemophilus Test Medium  Inóculo  suspensão direta  Incubação  35 o C em atm. 5% CO 2  Leitura  16 a 18

77 Neisseria gonorrhoeae ò Suspeita de falência terapêutica ò Vigilância ò Estudos para orientar terapia empírica NCCLS.M100 -S15, 2005

78 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” äC. freundii äEnterobacter spp äSerratia spp CEFOXITINA äCitrobacter spp äEnterobacter spp äSerratia spp Amp/A. clavulânico e Amp/sulbactam Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

79 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” äCitrobacter freundii äEnterobacter spp äM. morgani äP. vulgaris äP. penneri äProvidencia spp äSerratia spp äYersinia enterocolitica CEFALOTINA Enterobacteriaceae Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

80 “RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” äCitrobacter freundii äEnterobacter spp äKlebsiella spp äM. morgani äP. vulgaris äP. penneri äProvidencia spp äSerratia spp äYersinia spp AMPICILINA Enterobacteriaceae Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

81 Perfis encontrados nos testes de sensibilidade que requerem nova avaliação da amostra. MicrorganismosPerfil de sensibilidade a ser investigado Enterobacteriacea Resistência a carbapenems E. coli e K. pneumoniae Resistência às cefalosporinas de 3ª geração ou monobactans P.aeruginosa e A.baumanniiResistência à polimixina S. maltophilliaSensibilidade aos carbapenems e/ou resistência ao sulfam/trimetoprim N. meningitidisResistência à penicilina N. gonorrhoeaeResistência à ceftriaxona Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

82 Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos  A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia.  O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos  É necessário uma atualização constante dos protocolos e a freqüente implementação de novos testes e metodologias.  Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes são obrigados a estarem em constante atualização

83 Muito obrigada! Antonia Maria de Oliveira Machado


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