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Neutrófilo, MEV Injetando DNA exógenos no núcleo de um ovo de camundongo, microscopia de luz polarizada Monócitos do sangue, MEV Bacilus anthracis Células.

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1 Neutrófilo, MEV Injetando DNA exógenos no núcleo de um ovo de camundongo, microscopia de luz polarizada Monócitos do sangue, MEV Bacilus anthracis Células Fermento, MET

2 Macrófago, MET Trypanosoma brucei Glóbulos vermelhos Linfócito-T, MET Linfócitos, microscopia óptica Glóbulos vermelhos

3 Neurônios do córtex cerebral Corte, microscopia óptica Célula epitelial de rim de canguru Microscopia de fluorescência Vermelho: actina Verde: microtúbulos Azul: DNA Microscopia eletrônica de transmissão Mitocôndria, TME

4 Tecido muscular estriado Epitélio estratificado ceratinizado (pele) Tecidos

5 Intestino delgado Córtex renal e glomérulo Ilhota pancreática

6 Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Realidade ou Ilusão? Marco Antonio Zago Instituto de Física São Carlos USP Agosto – 2011 Universidade de São Paulo

7 I have seen a medicine Thats able to breathe life into a stone, Quicken a rock, and make you dance canary With spritely fire and motion, whose simple touch Is powerful to araise King Pippen, nay, To give great Charlemain a pen in 's hand And write to her a love-line. W. Shakespeare All's Well That Ends Well A Miraculous Medicine Universidade de São Paulo

8 Terapia Celular

9 Conjunto de novas técnicas ou métodos para substituir células doentes ou disfuncionais com células sadias Imunoterapia: células dendríticas Aférese, criopreservação, imunosseleção Terapia gênica Medicina regenerativa (substituição de tecidos, células e órgãos) Transplantes de células hematopoéticas Universidade de São Paulo

10 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Doenças ósteo-articulares Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral Universidade de São Paulo

11 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Doenças ósteo-articulares Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Universidade de São Paulo

12 Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano Células tronco para a cegueira Notícias na Imprensa Universidade de São Paulo

13 Degeneração Macular Relacionada à Idade Forma úmidaProliferação vascular Forma secaAtrofia 10% casosMais grave Várias formas de tratamento Não há tratamento90% casos Universidade de São Paulo

14 Fibroblastos humanos iPS OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 NeuralCartilagem Epitélio Intestinal iPSEPR Epitélio Pigmentado Retiniano Universidade de São Paulo

15 Fibroblastos humanos iPS OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 EPR Epitélio Pigmentado Retiniano NeuralCartilagem Epitélio Intestinal Royal College of Surgeons dystrophic rats Universidade de São Paulo

16 Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Córnea Conjuntiva Limbo Córnea e células tronco Universidade de São Paulo

17 Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Córnea Conjuntiva Limbo Córnea e células tronco Deficiência parcial Destruição (queimadura) Invasão da córnea pelo epitélio conjuntival Neovascularização Inflamação Cicatrização Universidade de São Paulo

18 Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration Sucesso82 (77%) Sucesso parcial14 (13%) Insucesso11 (10%) p63-bright cells: holoclone forming cells in culture Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas Antes Depois NEJ Medicine 363:147, 2010 Universidade de São Paulo

19 Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira PESQUISA O Globo RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria..... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética..... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular. Células tronco hematopoéticas Células tronco mesenquimais Universidade de São Paulo

20 Bone Marrow Peripheral Blood Umbilical Cord Ficoll-Hypaque gradient Metho-Cult GF- H4434 medium 14 days 37 o C 5% CO 2 Colonies Mono- nuclears Universidade de São Paulo

21 CFU-GM BFU-E Universidade de São Paulo

22 CFU-GEMM CFU-GM Universidade de São Paulo

23 - MEM 20% Fetal Calf Serum Mono- nuclears Bone Marrow Umbilical Vein Ficoll-Hypaque gradient Weekly Trypsin Detach cells 14 days 72 hours Remove non-adherent cells

24 Insulina Dexametasone Indometacina Diferenciação Adipocítica Dexametasone Ácido ascórbico Diferenciação Osteoblástica

25 Tecidos Adultos Fontes de MSC em Humanos Tecidos Fetais Placenta Medula óssea Tecido adiposo Veias e artérias Medula óssea fetal Fígado fetal Sague periférico fetal Sangue de cordão umbilical Veia de cordão umbilical Gônadas Células fetais Células maternas Universidade de São Paulo

26 MSC de veia umbilical MSC Sudan II Fosfatase Alcalina Von Kossa H.E. Colágeno II

27 mammalian Target of Rapamycin mTOR (FRAP1) Serina/treonina proteino-cinase Síntese Ciclina D1 Proliferação celular Angiogênse Proteínas angiogênicas TSC1 e TSC2 Ativa metabolismo Deleção de PTENSíndrome mielodisplásica Leucemias Inibidores de mTOR rapanalogs Tratamento de câncer PTEN regulador (inibidor) de mTOR mTOR Inibidores de mTOR Universidade de São Paulo

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29 Células-tronco: Propriedades e Fontes

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32 Blastocisto

33 Todos os tecidos do adulto Universidade de São Paulo

34 Células-tronco Embrionárias Lygia V. Pereira Instituto de Biologia USP adipócitos epitélio neurônios fibras musculares CT embrionários blastocisto * * corpo embrióide Universidade de São Paulo

35 Propriedade Fundamental das Células-Tronco Divisão Assimétrica Universidade de São Paulo

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37 Célula-tronco Instestinal Universidade de São Paulo

38 Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog Universidade de São Paulo

39 TrofoectodermaEndoderma Progenitores Cels Maduras Embrião +Gata4/5+Cdx2 Células BMacrófagos +Cebp Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa MúsculosFibroblastos +Myod Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Massa Interna CT Embrionária +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Universidade de São Paulo

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41 Takahashi & Yamanaka Teratomas derivados de iPS Universidade de São Paulo

42 TrofoectodermaEndoderma Progenitores Cels Maduras Embrião +Gata4/5+Cdx2 Células BMacrófagos +Cebp Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa MúsculosFibroblastos +Myod Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Massa Interna CT Embrionária +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Universidade de São Paulo

43 Células Tronco Células tronco pluripotentes células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias) células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas) iPS (induced pluripotent stem cell) Células tronco de adultos medula óssea vasos músculos esqueléticos fígado cérebro dentes intestino pele coração Universidade de São Paulo

44 Uso Terapêutico

45 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueria Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Doenças ósteo-articulares Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral Universidade de São Paulo

46 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueira Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Universidade de São Paulo

47 Células tronco embrionários Células iPS Células tronco adultas tecido-específica Estratégias de Terapia com Células Tronco Células totipotentes Isolamento Enriquecimento, cultura Injeção/transplante Fonte de Células Estratégia Cultura Diferenciação Injeção/transplante Medula óssea Pele Olho S. nervoso Universidade de São Paulo

48 Nature 410:701, 2000 Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa mm Hg LVEDP Transplanted cells Infarcted myocardium Unknown molecular signal(s) Cell migration to damaged area Proliferation and differentiation Cytoplasmic proteins Cardiac myosin -Sarcomeric actin Connexin 43 Nuclear proteins Csx/Nkx2.5 MEF2 GATA-4 Functional competence C Infarction + BM cells Universidade de São Paulo

49 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

50 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

51 Pesquisa Básica Pesquisa Translacional Pesquisa Clínica Evidência Médica Sólida Mudança da Abordagem Médica Resultados Avaliação Universidade de São Paulo

52 Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores Trials com resultados convincentes Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais Evidência Médica Sólida Universidade de São Paulo

53 Não, não há evidência Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico? Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora, Evidência Médica Sólida Universidade de São Paulo

54 Terapia Celular Substituição do tecido doente ou destruído Células tronco tecido-específicas Transplante de medula óssea Pele cultivada Transplante de células pancreáticas Células tronco embrionárias ou células iPS Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos Mesenquimais: osso e cartilagem Universidade de São Paulo Estratégias S

55 Imunoterapia + Transplante autólogo Efeito imuno-modulador Diabete melito tipo I Células tronco mesenquimais Universidade de São Paulo Terapia Celular Estratégias Células modificadas (antitumorais) Linfócitos T autólogos anti-CD19 na LLC

56 Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos MSC não originam cardiomócitos Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinais Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio MSC são imunossupressoras MSC poderiam reduzir reação inflamatória Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas Universidade de São Paulo

57 Heart Disease Myocardial Ischemia Myocardial Infarction Coronary Disease Heart Failure Cardiomyopathies Hypertension Peripheral Vascular Disease Stroke Diabetic Angiopathies Intracranial Hemorrhages C No Condition Stem Cell All Evidence* Clinical Trials *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results Registered Clinical Trials with Stem Cells

58 Graft-versus-Host Disease Heart Disease Myocardial Ischemia Heart Failure Autoimmune Diseases Bone Diseases Diabetes Mellitus Peripheral Vascular Disease Stroke Intestinal Disease All studies C No No No Condition MSC Stem Cells Evidence* Clinical Trials *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results Registered Clinical Trials with MSC

59 Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes. Universidade de São Paulo

60 N= 20N= 46N= 51 Universidade de São Paulo

61 BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI Follow-up (mos) Control/placebo Treatment Improvement LVEF C/P 51-54% 47-49% 43-49% 47-50% Treatment 50-56% 49-52% 41-49% 48-54% Mortality + Reinfarct C/P 3% 0% 0% 6% Treatment 3% 6% 2% 2% Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction Universidade de São Paulo

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63 EF 3-4% Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies Universidade de São Paulo

64 CaptoprilRamipril Captopril Valsantan Carvedilol Universidade de São Paulo

65 Changes in functional and morphometric parameters of LV In the range observed with: Reperfusion therapy Beta-blockers Interventions in the renin-angiotensin pathway Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells Increase in LVEF = 3-4% Universidade de São Paulo

66 Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio Choque cardiogênico40% Insuficiência cardíaca1 bilhão miócitos 25% Destruição celular Infarto Ventrículo Esquerdo 200 g = 4 x 10 9 miócitos Universidade de São Paulo

67 Regeneração Cardíaca Verdadeira Restauração 1 x 10 9 miócitos Inserção nos sítios adequados Junção eletromecânica Contração síncrona com o restante do miocárdio Universidade de São Paulo

68 Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos Medula Óssea a Recipiente Doador LacZ Lesão Purificação Células LacZ-positivas Fibrose Cardiomiócito (sem LacZ) b Doador GFP Recipiente Transfusão direta Células GFP-positivas Fibrose Cardiomiócito (sem GFP)

69 Cardiomiócitos Mioblastos esqueléticos Músculos lisos Fibroblastos Precursores endoteliais Medula óssea (total ou frações) Células-tronco mesenquimais Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Sem sucesso Universidade de São Paulo

70 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Perspectivas Progenitores miocárdicos residentes Células-tronco embrionárias Injeção de fatores de crescimento Transplante de células modificadas (terapia gênica) iPS com diferenciação cardíaca Universidade de São Paulo

71 iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero Nelson et al, Circulation, 2009 Universidade de São Paulo

72 iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental Nelson et al, Circulation, 2009 Universidade de São Paulo

73 Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism. The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS- derived integrated functional tissue. Nelson et al, Circulation, 2009 Universidade de São Paulo

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75 Bone marrow biopsy CT scans Universidade de São Paulo

76 Perspectivas

77 Células Tronco Tecido-específicas Abordagens gerais Perspectivas para Terapias Inovadoras Reprogramação Nuclear (iPS) Transdiferenciação Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s) Células Tronco Mesenquimais Aplicações Específicas ou Focalizadas Transdiferenciação Universidade de São Paulo

78 Isolamento em números significativos Indução mais fisiológica Obter a diferenciação correta Excluir células pluripotenciais Eficiência de indução Células Tronco Tecido Específicas iPS Terapias Inovadoras: os Gargalos Obter a célula ou a combinação correta Universidade de São Paulo

79 Células-tronco na natureza

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