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Células Neutrófilo, MEV Fermento, MET Bacilus anthracis

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Apresentação em tema: "Células Neutrófilo, MEV Fermento, MET Bacilus anthracis"— Transcrição da apresentação:

1 Células Neutrófilo, MEV Fermento, MET Bacilus anthracis
Injetando DNA exógenos no núcleo de um ovo de camundongo, microscopia de luz polarizada Monócitos do sangue, MEV

2 Trypanosoma brucei Glóbulos vermelhos Macrófago, MET Linfócito-T, MET Linfócitos , microscopia óptica Glóbulos vermelhos

3 Neurônios do córtex cerebral
Corte, microscopia óptica Microscopia eletrônica de transmissão Célula epitelial de rim de canguru Microscopia de fluorescência Vermelho: actina Verde: microtúbulos Azul: DNA Mitocôndria, TME

4 Epitélio estratificado ceratinizado
Tecidos Epitélio estratificado ceratinizado (pele) Tecido muscular estriado

5 Córtex renal e glomérulo
Intestino delgado Ilhota pancreática

6 Instituto de Física São Carlos
Universidade de São Paulo Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Realidade ou Ilusão? Marco Antonio Zago Instituto de Física São Carlos USP Agosto – 2011

7 A Miraculous Medicine I have seen a medicine
Universidade de São Paulo A Miraculous Medicine I have seen a medicine That’s able to breathe life into a stone, Quicken a rock, and make you dance canary With spritely fire and motion, whose simple touch Is powerful to araise King Pippen, nay, To give great Charlemain a pen in 's hand And write to her a love-line. W. Shakespeare All's Well That Ends Well

8 Terapia Celular

9 Universidade de São Paulo
Terapia Celular Conjunto de novas técnicas ou métodos para substituir células doentes ou disfuncionais com células sadias Medicina regenerativa (substituição de tecidos, células e órgãos) Transplantes de células hematopoéticas Imunoterapia: células dendríticas Aférese, criopreservação, imunosseleção Terapia gênica

10 Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Doenças ósteo-articulares Doenças hematológicas Doenças metabólicas Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral

11 Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Universidade de São Paulo Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Doenças ósteo-articulares Doenças hematológicas Doenças metabólicas

12 Células tronco para a cegueira
Universidade de São Paulo Células tronco para a cegueira Notícias na Imprensa Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano

13 Degeneração Macular Relacionada à Idade
Universidade de São Paulo Degeneração Macular Relacionada à Idade Forma “úmida” Proliferação vascular 10% casos Mais grave Várias formas de tratamento Forma “seca” Atrofia 90% casos Não há tratamento

14 Fibroblastos humanos iPS iPS EPR Universidade de São Paulo
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Epitélio Pigmentado Retiniano Neural Cartilagem Epitélio Intestinal

15 Royal College of Surgeons
Universidade de São Paulo Fibroblastos humanos OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Neural Cartilagem Epitélio Intestinal Epitélio Pigmentado Retiniano Royal College of Surgeons dystrophic rats

16 Córnea e células tronco
Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea

17 Córnea e células tronco
Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea Neovascularização Inflamação Cicatrização Deficiência parcial Destruição (queimadura) Invasão da córnea pelo epitélio conjuntival

18 Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration
Universidade de São Paulo Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas Antes Depois NEJ Medicine 363:147, 2010 Sucesso 82 (77%) Sucesso parcial 14 (13%) Insucesso 11 (10%) p63-bright cells: holoclone forming cells in culture

19 Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira
Universidade de São Paulo PESQUISA Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira O Globo RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética. .... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular. Células tronco hematopoéticas Células tronco mesenquimais

20 Universidade de São Paulo
Metho-Cult GF-H4434 medium 14 days 37o C 5% CO2 Colonies Mono- nuclears Ficoll-Hypaque gradient Bone Marrow Peripheral Blood Umbilical Cord

21 Universidade de São Paulo
BFU-E BFU-E CFU-GM

22 Universidade de São Paulo
CFU-GM CFU-GEMM

23 Ficoll-Hypaque gradient
 - MEM 20% Fetal Calf Serum Mono- nuclears Bone Marrow Umbilical Vein Ficoll-Hypaque gradient 72 hours Remove non-adherent cells Weekly Trypsin Detach cells 14 days

24 Diferenciação Osteoblástica Diferenciação Adipocítica
Dexametasone Ácido ascórbico Diferenciação Osteoblástica Insulina Dexametasone Indometacina Diferenciação Adipocítica

25 Fontes de MSC em Humanos
Universidade de São Paulo Fontes de MSC em Humanos Tecidos Adultos Medula óssea Tecido adiposo Veias e artérias Tecidos Fetais Medula óssea fetal Fígado fetal Sague periférico fetal Sangue de cordão umbilical Veia de cordão umbilical Gônadas Placenta Células fetais Células maternas

26 MSC de veia umbilical MSC Sudan II Fosfatase Alcalina Von Kossa H.E.
Colágeno II

27 Universidade de São Paulo
mTOR Síntese Ciclina D1 mTOR (FRAP1) Proliferação celular mammalian Target of Rapamycin Proteínas angiogênicas Angiogênse Serina/treonina proteino-cinase TSC1 e TSC2 Ativa metabolismo Inibidores de mTOR Inibidores de mTOR rapanalogs Tratamento de câncer PTEN regulador (inibidor) de mTOR Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásica Leucemias

28 Universidade de São Paulo

29 Células-tronco: Propriedades e Fontes

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31

32 Blastocisto

33 Universidade de São Paulo
Todos os tecidos do adulto

34 Células-tronco Embrionárias
Universidade de São Paulo Células-tronco Embrionárias CT embrionários blastocisto * corpo embrióide adipócitos epitélio neurônios fibras musculares Lygia V. Pereira Instituto de Biologia USP

35 Propriedade Fundamental das Células-Tronco
Universidade de São Paulo Propriedade Fundamental das Células-Tronco Divisão Assimétrica

36 Universidade de São Paulo

37 Célula-tronco Instestinal
Universidade de São Paulo Célula-tronco Instestinal

38 Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog
Universidade de São Paulo Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog

39 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Massa Interna CT Embrionária +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Progenitores Células B Macrófagos +Cebp Músculos Fibroblastos +Myod Cels Maduras Célula Acinar Célula  +Pdx1, Ng3n, Mafa

40 Universidade de São Paulo

41 Teratomas derivados de iPS
Universidade de São Paulo Teratomas derivados de iPS Takahashi & Yamanaka

42 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Massa Interna CT Embrionária +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Progenitores Células B Macrófagos +Cebp Músculos Fibroblastos +Myod Cels Maduras Célula Acinar Célula  +Pdx1, Ng3n, Mafa

43 Células Tronco Células tronco pluripotentes Células tronco de adultos
Universidade de São Paulo Células Tronco Células tronco pluripotentes células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias) células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas) iPS (induced pluripotent stem cell) Células tronco de adultos medula óssea vasos músculos esqueléticos fígado cérebro dentes intestino pele coração

44 Uso Terapêutico

45 Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueria Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças ósteo-articulares Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral

46 Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Universidade de São Paulo Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueira Doenças hematológicas Doenças metabólicas

47 Estratégias de Terapia com Células Tronco
Universidade de São Paulo Estratégias de Terapia com Células Tronco Fonte de Células Estratégia Células totipotentes Cultura Diferenciação Injeção/transplante Células tronco embrionários Células iPS Células tronco adultas tecido-específica Isolamento Enriquecimento, cultura Injeção/transplante Medula óssea Pele Olho S. nervoso

48 Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium
Universidade de São Paulo Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa Nature 410:701, 2000 Transplanted cells Infarcted myocardium Unknown molecular signal(s) Cell migration to damaged area Proliferation and differentiation Cytoplasmic proteins Cardiac myosin -Sarcomeric actin Connexin 43 Nuclear proteins Csx/Nkx2.5 MEF2 GATA-4 Functional competence 40 30 20 10 mm Hg LVEDP C Infarction + BM cells

49 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

50 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

51 Evidência Médica Sólida
Universidade de São Paulo Pesquisa Básica Pesquisa Translacional Pesquisa Clínica Evidência Médica Sólida Mudança da Abordagem Médica Resultados Avaliação

52 Evidência Médica Sólida
Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Trials com resultados convincentes Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais

53 Evidência Médica Sólida
Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora, Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico? Não, não há evidência

54 Terapia Celular Estratégias Substituição do tecido doente ou destruído
Universidade de São Paulo Terapia Celular Estratégias Substituição do tecido doente ou destruído S Células tronco tecido-específicas Transplante de medula óssea Transplante de células pancreáticas Mesenquimais: osso e cartilagem Pele cultivada Células tronco embrionárias ou células iPS Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos

55 Terapia Celular Estratégias Imunoterapia + Transplante autólogo
Universidade de São Paulo Terapia Celular Estratégias Imunoterapia + Transplante autólogo Diabete melito tipo I Efeito imuno-modulador Células tronco mesenquimais Células modificadas (antitumorais) Linfócitos T autólogos anti-CD19 na LLC

56 Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas
Universidade de São Paulo Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos MSC não originam cardiomócitos Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinais Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio MSC são imunossupressoras MSC poderiam reduzir reação inflamatória Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente

57 Registered Clinical Trials with “Stem Cells”
Condition Stem Cell All Evidence* Clinical Trials Heart Disease Myocardial Ischemia Myocardial Infarction Coronary Disease Heart Failure Cardiomyopathies Hypertension 127 101 62 44 36 20 9 4.489 2.010 631 1.433 934 218 2.218 C No Peripheral Vascular Disease Stroke Diabetic Angiopathies Intracranial Hemorrhages 17 13 3 1 272 887 226 119 No *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results

58 Registered Clinical Trials with MSC
Condition MSC Stem Cells Evidence* Clinical Trials Graft-versus-Host Disease Heart Disease Myocardial Ischemia Heart Failure Autoimmune Diseases Bone Diseases Diabetes Mellitus 2 15 8 7 2 216 127 101 36 51 23 13 C No Peripheral Vascular Disease Stroke Intestinal Disease All studies 1 5 82 17 13 35 2.641 No *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results

59 Universidade de São Paulo
Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.

60 Universidade de São Paulo

61 Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction
Universidade de São Paulo Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI Follow-up (mos) Control/placebo Treatment Improvement LVEF C/P % % % % Treatment % % % % Mortality + Reinfarct C/P % % 0% % Treatment 3% % 2% %

62 Universidade de São Paulo

63 Universidade de São Paulo
Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies ↑EF 3-4%

64 Universidade de São Paulo
Captopril Valsantan Captopril Ramipril Carvedilol

65 Universidade de São Paulo
Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells Increase in LVEF = 3-4% Changes in functional and morphometric parameters of LV In the range observed with: Reperfusion therapy Beta-blockers Interventions in the renin-angiotensin pathway

66 Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio
Universidade de São Paulo Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio Ventrículo Esquerdo 200 g = 4 x 109 miócitos Destruição celular Infarto Insuficiência cardíaca 1 bilhão miócitos 25% Choque cardiogênico 40%

67 Regeneração Cardíaca Verdadeira
Universidade de São Paulo Regeneração Cardíaca Verdadeira Restauração 1 x 109 miócitos Inserção nos sítios adequados Junção eletromecânica Contração síncrona com o restante do miocárdio

68 a b Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos Purificação
Células LacZ-positivas Fibrose Medula Óssea Doador LacZ Lesão Recipiente Cardiomiócito (sem LacZ) b Células GFP-positivas Fibrose Doador GFP Transfusão direta Cardiomiócito (sem GFP) Recipiente

69 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Universidade de São Paulo Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Sem sucesso Cardiomiócitos Mioblastos esqueléticos Músculos lisos Fibroblastos Precursores endoteliais Medula óssea (total ou frações) Células-tronco mesenquimais

70 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Universidade de São Paulo Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Perspectivas Progenitores miocárdicos residentes Células-tronco embrionárias Injeção de fatores de crescimento Transplante de células modificadas (terapia gênica) iPS com diferenciação cardíaca

71 iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero
Universidade de São Paulo iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero Nelson et al, Circulation, 2009

72 iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental
Universidade de São Paulo iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental Nelson et al, Circulation, 2009

73 Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis
Universidade de São Paulo Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism. The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS-derived integrated functional tissue. Nelson et al, Circulation, 2009

74 Universidade de São Paulo

75 Universidade de São Paulo
CT scans Bone marrow biopsy

76 Perspectivas

77 Perspectivas para Terapias Inovadoras
Universidade de São Paulo Perspectivas para Terapias Inovadoras Abordagens gerais Transdiferenciação Transdiferenciação Células Tronco Tecido-específicas Reprogramação Nuclear (iPS) Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s) Células Tronco Mesenquimais Aplicações Específicas ou Focalizadas

78 Terapias Inovadoras: os Gargalos
Universidade de São Paulo Terapias Inovadoras: os Gargalos Células Tronco Tecido Específicas Isolamento em números significativos Obter a célula ou a combinação “correta” iPS Eficiência de indução Indução mais “fisiológica” Obter a diferenciação “correta” Excluir células pluripotenciais

79 Células-tronco na natureza

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