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Fundação Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Oceanografia Disciplina de Poluição Marinha Ítalo Braga de Castro CROMATOGRAFIA (aula 1)

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1 Fundação Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Oceanografia Disciplina de Poluição Marinha Ítalo Braga de Castro CROMATOGRAFIA (aula 1)

2 Definição: É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura por interação entre uma fase estacionária e uma fase móvel. Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado com sólido) que permanece dentro da coluna de separação. Fase Móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através da coluna, carregando os solutos.

3 Histórico: M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO 3 mistura de pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego)

4 Princípio:

5 1-De acordo com o sistema cromatográfico Em Coluna Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa Cromatografia Supercrítica Planar Cromatografia em Camada Delgada (CDC) Cromatografia em Papel (CP) Classificação:

6 2-De acordo com a Fase Móvel Utilização de Gás Cromatografia Gasosa (CG) Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) Utilização de Líquido Cromatografia Líquida Clássica (CLC) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Utilização de Gás Pressurizado Cromatografia Supercrítica (CSC) Classificação:

7 3-De acordo com a Fase Estacionária Líquida Sólida Quimicamente Ligadas 4-De acordo com o Modo de Separação Por adsorção Por partição Por troca iônica Classificação:

8 Mecanismos de separação: Processos físicos -> Sorção atrações polares

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10 S CROMATOGRAFIA Em coluna Planar L L F L CP CCD Gás L S F L CGL CGS CGFL Fluído supercrítico F L L CSS CSFL Líquido L S CLL CLS CE F L CLFL CTI CB Tipos de Cromatografia Fase Móvel Técnica Fase Estacionária Classificação:

11 - Cromatografia Planar Líquido-líquido - Princípio: partição – relaciona a diferença de solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase móvel e fase estacionária; - Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular - Análise qualitativa: Rf (fator de retenção); Rf = distância percorrida pela substância distância percorrida pela fase móvel Cromatografia em Papel:

12 Método rápido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromogênicos Maior sensibilidade que C.P. (10 -9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Método simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (sílica, alumina, celite, amido) Métodos de detecção: físico-químicos Princípio: Adsorção (polaridade) Cromatografia em camada delgada:

13 Pode ser também chamada de cromatografia líquida clássica. FE – sílica e alumina; FM – eluente; PRINCÍPIO: adsorção Cromatografia em coluna:

14 FASE MÓVEL injeçãoseparaçãoeluição Fase estacionária DETECTOR Cromatografia Gasosa:

15 Em CG a FE pode ser: Sólida Líquida Cromatografia Gás-Sólido (CGS) Cromatografia Gás-Líquido (CGL) FE sólida com uma grande área superficial e a separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias neste sólido. FE líquida pouco volátil recobrindo um suporte sólido ou as paredes da coluna capilar. A separação baseia-se em mecanismo de partição das substâncias entre a fase líquida e gasosa. Cromatografia Gasosa:

16 Rapidez Alto poder de separação Separação de várias classes de compostos em uma análise Sensibilidade (ppm - ppb) Facilidade de registrar dados Variedade de detetores (especificidade) Amostras voláteis Compostos termicamente estáveis Técnicas auxiliares p/ identificação Cromatografia Gasosa:

17 Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (evaporáveis) (para uma substância qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gás ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que sejam termicamente estáveis. Cromatografia Gasosa (Aplicações):

18 Ambiental Pesticidas, organoclorados e PCBs Hidrocarbonetos Aminas e fenóis Alimentos Análise de ácidos graxos e triglicerídeos Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico de alimentos Análise de açúcares e aminoácidos Farmacêutica Química Forense/Toxicologia Doping Metabólitos de drogas Química Industrial Petroquímica Cromatografia Gasosa (Aplicações):

19 Cromatógrafo de Fase Gasosa:

20 Cromatografia Gasosa: 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento de Sinal. 6 - Registro

21 Gás de Arraste: GÁS DE ARRASTE Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE H 2 O, O 2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

22 Requisitos: CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) Gás de Arraste:

23 Componentes necessários à linha de gás: controladores de vazão / pressão de gás dispositivos para purificação de gás (traps) Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário 3 - Traps para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário 5 - Regulador de Vazão 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro) Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre Gás de Arraste:

24 Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica Injetor:

25 Injeção:

26 TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua decomposição. Regra Geral: T inj = 50 o C acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada = 3,2 mm ( 1 / 4 ) 0,1 ml mL 0,2 L L capilar = 0,25 mm 0,001 ml... 0,1 mL 0,01 L... 3 L Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução Injeção:

27 êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microseringa de 10 L: Microseringa:

28 EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pul- verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recober- tas com um filme fino (fra- ção de m) de FE líquida ou sólida Colunas:

29 Colunas (parâmetros): Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p 0 ). p 0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)

30 TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG Colunas (parâmetros):

31 Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. Detectores:

32 UNIVERSAIS : Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS : Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS : Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas Detectores:

33 ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DIC FID Detector por Ionização em Chama DCE ECD Detector por Captura de Eletrons EM MS Detector Es- pectrométrico de Massas

34 Detectores: DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA ( DCT OU TCD ) É um Detector de 2 canais mede a diferença, em Condutividade Térmica, entre o Gás de Arraste (Referência) e o do Gás de Arraste + Amostra (analítico) possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal, formando uma ponte. As vazões dos 2 canais devem ser praticamente iguais A presença de um componente, dissolvido no Gás de arraste, ao atingir o canal analítico muda a resistência deste filamento, provocando um desequilíbrio na ponte que gera um sinal proporcional a quantidade deste A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento, concentração dos componentes e da diferença da Condutividade Térmica entre o Gás de arraste e o componente.

35 TCD:

36 DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA ( DIC OU FID ). Detectores: baseia-se no princípio de que a concentração de um composto é diretamente proporcional a concentração das partículas ionizadas presentes no mesmo O Gás de arraste e os componentes que eluem da Coluna atingem a chama. Esta ioniza (queima) as moléculas orgânicas presentes na corrente gasosa. As partículas ionizadas, entre os eletrodos, gera uma corrente que é medida através de uma resistência

37 Hydrogen in Air in Collector Flame jet Column connection FID:

38 DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS ( DCE OU ECD ) Detectores: É um Detector seletivo, específico para análises de Compostos Eletrofílicos (como os Halogênios nos Clorados). A cela do ECD é revestida internamente por uma lâmina do isótopo radioativo de Ni-63. As Partículas Beta emitidas pelo isótopo ionizam o Carrier e os Íons e Elétrons resultantes migram para o anodo coletor por influencia de uma voltagem polarizada pulsante, aplicada entre a fonte e o coletor A freqüência de pulsação é controlada para manter a corrente constante e é a geradora do sinal analítico. É um Detector não destrutivo e altamente sensível, ideal para análise de pesticidas e agrotóxicos clorados

39 Collector 63 Nickel foil Make-up gas in Column connection ECD:

40 Detectores: DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS A GC/MS é uma técnica analítica, também bastante conhecida, que visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de uma mistura. Os componentes da amostra, previam. separados no GC, são transferidas p/ o MS, através De uma linha de transferência. No MS ocorre a fragmentação da molécula e a detecção, possibilitando ao usuário o detalhamento da estrutura e o peso molecular do composto. Utilizando uma biblioteca específica podemos identificar positivamente o composto, baseado na abundância dos seus fragmentos (ions).

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42 Espectro de Massa (TBT):

43 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA (CLC) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (CLAE) Cromatografia Líquida:

44 Esquema para CLC: Preparo da coluna Aplica-se a amostra Eluente Detecção e quantificação (espectroscopia ou gravimetria) Cromatografia Líquida:

45 Esquema para CLAE: Coluna fechada Injeção de amostra Detector Cromatogramas Cromatografia Líquida:

46 Características da Fase Móvel usada em CLAE: Alto grau de pureza ou de fácil purificação; Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes; Não decompor ou dissolver a FE; Ter baixa viscosidade; Ser compatível ao detector utilizado; Ter polaridade adequada para permitir uma separação dos componentes da amostra. Cromatografia Líquida de Alta Resolução:

47 Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE: aminoácidos; explosivos; lipídeos polares; metabólicos de animais e plantas; pigmentos de plantas; produtos farmacêuticos; proteínas; tintas. Cromatografia Líquida de Alta Resolução:

48 FATORCGCLAE Requisitos para amostra Amostra volátil ou derivatizável, termicamente estável na temperatura de operação do sistema cromatográfico. Amostra solúvel na fase móvel. Tipos de amostras Gases, líquidos ou sólidos MM: 2 a 1200 Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. MM: 32 a Quantidades mínimas detectáveis g10 -9 Tempo de análise Minutos até poucas horas Capacidade analítica Excelente, separação de amostras com até 200 componentes. Excelente, separação de amostras com até 50 componentes. Tempo de treinamento para um operador Cerca de 3 meses.Pelo menos 6 meses. Comparação entre CG e CLAE:

49 A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separação deficiente de analitos com retenções próximas. Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. Eficiência dos sistemas cromatográficos:

50 Fontes de Informações Qualitativas RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas Identificação individual das espécies contidas na amostra Determinação da identidade da amostra propriamente dita Aplicações Qualitativas de CG Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados provenientes de pelo menos duas fontes Análise Qualitativa:

51 t R = f Interações analito / FE Pressão de vapor do analito Condições operacionais Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito Análise Qualitativa: (tempos de retenção)

52 Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos eluídos: Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Absorção no Infra- Vermelho (CG-EIV) Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica de Massas (CG-EM) Cromatografia Gasosa com Detecção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA) Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção Análise Qualitativa: (métodos de detecção)

53 Padrões cromatográficos: Padrões Externos (Identificação) Internos (Quantificação) Surogates (Recuperação)

54 Controle de Qualidade dos dados: Programas de Intercalibração Materiais de referência

55 Cromatogramas:

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