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Rompimento não-Mecânico 1) Choque Osmótico  Não ocorre rompimento total das células;  Pode propiciar a permeabilização seletiva;  As células são mantidas.

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1 Rompimento não-Mecânico 1) Choque Osmótico  Não ocorre rompimento total das células;  Pode propiciar a permeabilização seletiva;  As células são mantidas por 30 minutos em meio com concentração de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC.  Mais indicado para bactérias Gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensível que as Gram-positivas.

2 Rompimento total e permeabilização seletiva

3 Congelamento-descongelamento  As células passam por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la formando poros permeáveis à biomolécula-alvo.  Fatores que mais influenciam:  tipo e idade da célula;  Temperatura  Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

4 Congelamento-descongelamento  Método de difícil implantação em grande escala  Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas

5 Termólise  Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier.  Sãos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido à sua simplicidade;  Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana;  Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimensões e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou centrifugação.

6 Termólise  Exemplos:  Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberação de enzimas intracelulares  Uma suspensão de Bacilus megaterium nas mesmas condições proporciona o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)

7 Rompimento Químico  Álcalis:  Adequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11  Método simples e de baixo custo;  Ocasiona geração de poluentes;

8 Rompimento Químico  Detergentes:  São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo;  A célula pode ser totalmente rompida;  Ex.: lauril sulfato de sódio, Triton, etc.  Formação de espuma e desnaturação e/ou precipitação de proteínas

9 Rompimento Químico  Solventes:  Consiste na desidratação das células, sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;  Adequado para biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente empregado;

10 Rompimento Químico  Lise enzimática:  Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmática é rompida pela pressão osmótica interna, após a parede celular, ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado.  Adequado para recuperação de biomoléculas sensíveis ao rompimento mecânico, temperatura, tensão de cisalhamento e elevadas pressões.  Fatores a ser considerados: presença de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima.

11 Rompimento Químico  Sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de microrganismo:  Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais hidrolisam componentes específicos da parede, como glucanas, proteínas e mananas.  Bactérias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligações covalentes da estrutura do peptideoglicano

12 Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano  Ex.: lisozima, catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas do peptideoglicano, mais eficiente no rompimentos de bactérias Gram- positivas.

13 Preservação da Biomolécula-alvo  Adição de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da degradação de proteínas);  Adição de agentes redutores (para evitar a oxidação dos sítios ativos das enzimas após o rompimento);  Adição de nucleases ou proteases podem melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse;  Alteração de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

14 Etapas de um Processo de Purificação Baixa resolução Alta resolução

15 Métodos de Purificação de Baixa Resolução  Precipitação  Separação por membranas  Extração em sistemas de duas fases líquidas

16 Precipitação

17  Um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação;  É um método moderado de purificação já que não apresenta elevada capacidade de separação de diferentes proteínas;  Métodos agressivo para recuperação de proteínas, pois sua função tridimensional é modificada, e a função bioquímica de uma proteína depende de sua estrutura;  É viável quando a função bioquímica é recuperada após a precipitação

18 Precipitação PrecipitantePrincípioVantagensDesvantagens Sais neutros (Salting-out) Interações hidrofóbicas pela redução da camada de hidratação da proteína - Uso universal- Corrosivo - Baixo custo- Liberação de amônia em pH alcalino Polímeros não-iônicosExclusão da proteína da fase aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da proteína - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Aumento da viscosidade Calorinterações hidrofóbicas e interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio, - Baixo custo- Risco de desnaturação - Simples Polieletró-litosLigação com a molécula de proteína atuando como agente floculante - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Precipitação isoelétricaNeutralização da carga global da proteína pela alteração do pH do meio - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Sais metálicosFormação de complexos- Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Solventes orgânicosRedução da constante dielétrica do meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares - Facilidade de reciclagem- Risco de desnaturação de proteínas - Facilidade na remoção do precipitado - Inflamável e explosivo

19 Estrutura das Proteínas  Constituição  Aminoácidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas.  Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução.

20 Estrutura das Proteínas  Estrutura primária: refere-se à seqüência dos aminoácidos na cadeia linear peptídica.  Estrutura secundária: refere-se ao grau de ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

21 Estrutura das Proteínas  Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária. Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína. As estruturas secundária e terciária conferem à proteína a sua estrutura tridimensional.

22 Estrutura das Proteínas Estrutura quaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas. Para sua estabilização concorrem ligações iônicas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes bissulfeto e interações hidrofóbicas.

23  Solubilidade de Proteínas Região Hidrofóbica (Apolar) Regiões Hidrofílicas (Polares) Determina sua solubilidade Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.

24  Solubilidade: resultado global das interações atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e soluto;  É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e solvente;  Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals;

25  pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos;  Carga total zero leva ao  da agregação devido à  repulsão => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH  O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.

26  pH e distribuição de cargas: pI - + De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

27 Desnaturação X Precipitação  A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso. - as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas.  A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína. - as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.

28  A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja recuperada, para que a mesma possa “exercer” sua função bioquímica após o processo.

29 Precipitação por sais  Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação  Salting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água que tornam-se escassas e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas, que expostas interagem e se agregam.  Os sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio.

30  Salting-in: redução na concentração de sais induz interações iônicas e agregação entre moléculas de proteína. Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (salting out) Globulinas se precipitam sob força iônica baixa

31 Precipitação por solventes  A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula;  Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros: precipitantes;  Deve ser miscível em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bom precipitante;  Mais usados: metanol, etanol e acetona;

32 Mecanismo Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.

33  Variáveis que afetam o processo  Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a desnaturação < 0º C podem garantir que não haja desnaturação adição do solvente  temperatura => deve ser lenta e sob refrigeração  pH: próximo ao pI favorece a precipitação

34 Precipitação por polímeros  PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar, neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização;  Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%);  4000 g/mol ou mais são os mais eficientes  Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;  Concentração depende do tamanho da molécula a ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína;  Remoção do polímero: ultrafiltração, adição de etanol, separação pela formação de duas fases aquosas pela adição de sais.

35  Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual;  Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico, utilizados para precipitar ácidos nucléicos e proteínas.  Mecanismo: Ocorre a agregação à proteína (floculação) ou eletrostático (neutralização de cargas); a proteína e o polieletrólito devem ter cargas opostas, por isso, deve-se operar longe do ponto isoelétrico da proteína. Precipitação pela temperatura  Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação => exposição de grupos hidrofóbicos que interagem e formam complexos insolúveis;

36 Precipitação isoelétrica  Resulta da atração eletrostática das proteínas quando estas estão próximas a seu pI;  Método bastante simples: ajuste do pH  Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas;  Vantagem: baixo custo  Desvantagem: possibilidade desnaturação  Obs.: Método útil para precipitar proteínas indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;


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