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Susana F. Domingues Estudo do efeito do citral na morfologia do esqueleto de peixe zebra durante os primeiros estados de desenvolvimento.

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1 Susana F. Domingues Estudo do efeito do citral na morfologia do esqueleto de peixe zebra durante os primeiros estados de desenvolvimento

2 Ácido retinóico Vitamina A (Retinol) Citral

3 Introdução  Tecido conjuntivo especializado que exerce uma função estrutural  Composta por células específicas:  Condroblastos e condrócitos  Produzem e segregam uma matriz extracelular Cartilagem

4 Introdução  Composto por um material extracelular calcificado  Matriz óssea  Três tipos de células:  Osteoblastos, osteocitos e osteoclastos  Formação do osso:  Mineralização directa da matriz, secretada pelos osteoblastos - ossificação intramembranosa  Deposição de matriz óssea substituindo a cartilagem – ossificação endocôndrica. Osso  Tecido conectivo dinâmico e especializado

5 Modelo Biológico  Teleósteo tropical de água doce  Elevada taxa fecundidade  Desenvolvimento rápido (3-4 meses)  Desenvolvimento embrionário externo  Ovos translúcidos Peixe zebra ( Danio rerio, Hamilton, 1822 )  Peixe zebra como modelo…  Manipulações genéticas  Embriologia  Extrapolar resultados para vertebrados superiores Adaptado de

6 Introdução  O citral é um óleo claro e líquido com odor a limão e sabor ligeiramente doce  Usado:  Agente edulcorante em pastilhas, rebuçados, gelados  Fragrância para sopas, detergentes, loções e perfumes  5 mg citral/kg de peso seco (Conselho da Europa, 1973)  Inibe a oxidação do retinol em ácido retinóico Citral Adaptado de Ress et al., 2003

7 Introdução  Interfere com a actividade biológica dos retinóides nos tecidos  Ratos (Connor & Smit, 1987; Connor, 1988)  Embriões de galinha (Nogueira et al., 1995) Citral

8 Introdução  Necessário:  Desenvolvimento ocular e visão nocturna  Pele saudável  Desenvolvimento e manutenção das células epiteliais  Correcta formação do osso e dos dentes  Armazenamento de lípidos  Síntese de proteínas e glicogénio Vitamina A  Retinol - Álcool de cadeia longa  Ácido retinóico - forma mais activa de vitamina A Adaptado de Ress et al., 2003

9  Regulador de expressão genética  Desenvolvimento dos vertebrados  Formação de estruturas e padronização dos eixos  Exemplo:  Desenvolvimento das asas das galinhas, onde o ácido retinóico induz a formação da dupla simetria dos elementos  Anfíbios (Xenopus) e peixe zebra, desenvolvimento das estruturas neural e mesodermal Introdução Ácido retinóico

10 Proteína Gla do osso (BGP) Proteína Gla da matriz (MGP) Ácido retinóico Vitamina A (Retinol) Citral

11 Introdução Proteína Gla do osso (BGP) e Proteína Gla da Matriz (MGP)

12 Objectivo  Determinar os efeitos do citral sobre:  Formação e mineralização do esqueleto  Expressão da BGP e MGP Durante as primeiras fases do desenvolvimento larvar de peixe zebra Efeito no desenvolvimento do organismo?

13 ArejadorTermóstato Recipientes Controle 5  g/l  g/l  g/l Aquário com água Procedimento experimental Idades de início do tratamento: 2, 4 e 7 DPH

14 PCR em tempo real Procedimento experimental Recolhas Vermelho alizarin Azul alcian 1.Von Kossa 2. In situ 3.Hematoxilina/eosina Observação e Medição à lupa HistologiaColoração osso cartilagem Extracção de ARN

15 PCR em Tempo Real  Acréscimo trizol ao meio de extracção  Extracção do RNA dos peixes (Centrifugação)  Recolha da parte sobrenadante  Adição de fenol clorofórmio  Verificação da pureza do RNA  Introdução do RNA na máquina de PCR juntamente com os primers adequados e nucleótidos  Comparação das sequências de codões

16 PCR em Tempo Real  Principais vantagens:  Grande Rapidez  Menor possibilidade de contaminação laboratorial  Mais específico sensível e reproduzível  Aplicações:  Estudo do padrão de expressão genética  Sequenciação directa de produtos amplificados  Estudos diagnósticos de doenças parasitárias, virais e bacterianas

17 Resultados e Discussão  Concentrações de 10  M e 20  M:  Alterações comportamentais durante o tratamento  Morte das larvas quando o meio é mudado  Atraso no desenvolvimento das estruturas Tratamento com 5  M de citral 10  M 20  M Controlo 5M5M

18 Comprimentos  Diminuição do comprimento das larvas de 20  M

19 Controlo 5  M Estruturas mineralizadas  Controlo:  Deposição de cálcio na matriz cartilagínea extracelular  Concentração de 5  M de citral:  Deposição de cálcio na periferia da cartilagem  Deposição de cálcio na cavidade do pericárdio Arcos branquiais Cavidade abdominal

20 Locais de expressão da MGP através de hibridação in situ  Controlo:  Expressão localizada nos condrócitos maturos e hipertróficos  5  M:  Expressão localizada nos condrócitos maturos  Matriz extracelular de maiores dimensões Controlo 5M5M BocaCabeça e arcos branquiaisTrabécula

21 5  M Controlo Histopatologia Intestino  Controlo:  Vilosidades intestinais com enterócitos de núcleo basal (células sanguíneas junto à parede do intestino)  Citoplasma ligeiramente granular  Concentração de 5  M:  Grande acumulação de pigmento nos enterócitos na zona apical  Estreitamento do epitélio intestinal

22 20  M Controlo 5  M Histopatologia  Controlo:  Hepatócitos poligonais, com citoplasma ligeiramente granular  Concentração de 5  M:  Desorganização do parênquima hepático Fígado  Hepatócitos com núcleos picnóticos com reduzido tamanho celular

23 Controlo 5  M Histopatologia  Concentração de 5  M:  Grande dilatação do lúmen  Forte estreitamento das células epiteliais Rim  Resultados semelhantes aos obtidos por outros autores com:  Insecticidas  Hidrocarbonetos aromáticos

24 Cleithrum Opérculo Cartilagem de Meckel Complexo caudal Vertebras pré-urais BOP (processo basi-occipital) Hipurais Desenvolvimento esquelético

25 Deformações esqueléticas Pré-ural Complexo caudal Hipural 5  M

26 Deformações esqueléticas  Encurvamento da coluna Deformações – Concentrações 5  M e 10  M Inibição do desenvolvimento – 20  m  Complexo caudal  Inibição da calcificação 

27 Considerações finais  Alterações:  Desenvolvimento  Estruturas ósseas  Comportamento (Movimento natatório)  Deformações (aumento):  Coluna vertebral  Complexo caudal  Hipurais  Vertebras pré-urais

28 Considerações finais  Anomalias:  Figado  Rim  Intestino  Deposição de cálcio na zona do coração  Efeito tóxico em larvas sujeitas a concentrações mais elevadas de citral – 10  M e 20  M

29  Futuramente…  Realização de mais amostragem utilizando concentrações menores de citral  Tratamento utilizando embriões em fases menos desenvolvidas

30 Agradecimentos  Professora Doutora Leonor Cancela  Paulo Gavaia Quem auxiliou a Susana  Carla Viegas no desenrolar deste  Juan Bosco projecto.  Sandra Marques

31 O nosso principal agradecimento  Susana Domingues


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