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PublicouHugo Junior Alterado mais de 9 anos atrás
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Estudo do efeito do citral na morfologia do esqueleto de peixe zebra durante os primeiros estados de desenvolvimento Susana F. Domingues
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Vitamina A (Retinol) Citral Ácido retinóico
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Introdução Cartilagem
Tecido conjuntivo especializado que exerce uma função estrutural Composta por células específicas: Condroblastos e condrócitos Produzem e segregam uma matriz extracelular
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Osso Introdução Composto por um material extracelular calcificado
Tecido conectivo dinâmico e especializado Composto por um material extracelular calcificado Matriz óssea Três tipos de células: Osteoblastos, osteocitos e osteoclastos Formação do osso: Mineralização directa da matriz, secretada pelos osteoblastos - ossificação intramembranosa Deposição de matriz óssea substituindo a cartilagem – ossificação endocôndrica.
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Peixe zebra (Danio rerio, Hamilton, 1822)
Modelo Biológico Peixe zebra (Danio rerio, Hamilton, 1822) Teleósteo tropical de água doce Elevada taxa fecundidade Desenvolvimento rápido (3-4 meses) Desenvolvimento embrionário externo Ovos translúcidos Adaptado de Peixe zebra como modelo… Manipulações genéticas Embriologia Extrapolar resultados para vertebrados superiores
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Introdução Citral O citral é um óleo claro e líquido com odor a limão e sabor ligeiramente doce Usado: Agente edulcorante em pastilhas, rebuçados, gelados Fragrância para sopas, detergentes, loções e perfumes 5 mg citral/kg de peso seco (Conselho da Europa, 1973) Inibe a oxidação do retinol em ácido retinóico Adaptado de Ress et al., 2003
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Citral Interfere com a actividade biológica dos retinóides nos tecidos
Introdução Citral Interfere com a actividade biológica dos retinóides nos tecidos Ratos (Connor & Smit, 1987; Connor, 1988) Embriões de galinha (Nogueira et al., 1995)
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Vitamina A Retinol - Álcool de cadeia longa Necessário:
Introdução Vitamina A Retinol - Álcool de cadeia longa Ácido retinóico - forma mais activa de vitamina A Adaptado de Ress et al., 2003 Necessário: Desenvolvimento ocular e visão nocturna Pele saudável Desenvolvimento e manutenção das células epiteliais Correcta formação do osso e dos dentes Armazenamento de lípidos Síntese de proteínas e glicogénio
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Ácido retinóico Regulador de expressão genética
Introdução Ácido retinóico Regulador de expressão genética Desenvolvimento dos vertebrados Formação de estruturas e padronização dos eixos Exemplo: Desenvolvimento das asas das galinhas, onde o ácido retinóico induz a formação da dupla simetria dos elementos Anfíbios (Xenopus) e peixe zebra, desenvolvimento das estruturas neural e mesodermal
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Citral Vitamina A (Retinol) Ácido retinóico Proteína Gla do osso (BGP)
Proteína Gla da matriz (MGP)
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Proteína Gla do osso (BGP) e Proteína Gla da Matriz (MGP)
Introdução Proteína Gla do osso (BGP) e Proteína Gla da Matriz (MGP)
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Objectivo Determinar os efeitos do citral sobre:
Formação e mineralização do esqueleto Expressão da BGP e MGP Durante as primeiras fases do desenvolvimento larvar de peixe zebra Efeito no desenvolvimento do organismo?
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Procedimento experimental
Arejador Termóstato Recipientes Controle 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l Aquário com água Idades de início do tratamento: 2, 4 e 7 DPH
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Procedimento experimental
Recolhas Observação e Medição à lupa Histologia Coloração osso cartilagem Extracção de ARN Von Kossa In situ Hematoxilina/eosina Vermelho alizarin Azul alcian PCR em tempo real
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PCR em Tempo Real Acréscimo trizol ao meio de extracção
Extracção do RNA dos peixes (Centrifugação) Recolha da parte sobrenadante Adição de fenol clorofórmio Verificação da pureza do RNA Introdução do RNA na máquina de PCR juntamente com os primers adequados e nucleótidos Comparação das sequências de codões
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Principais vantagens:
PCR em Tempo Real Principais vantagens: Grande Rapidez Menor possibilidade de contaminação laboratorial Mais específico sensível e reproduzível Aplicações: Estudo do padrão de expressão genética Sequenciação directa de produtos amplificados Estudos diagnósticos de doenças parasitárias, virais e bacterianas
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Resultados e Discussão
Controlo 5M 10M 20M Concentrações de 10M e 20M: Alterações comportamentais durante o tratamento Morte das larvas quando o meio é mudado Atraso no desenvolvimento das estruturas Tratamento com 5M de citral
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Comprimentos Diminuição do comprimento das larvas de 20 M
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Estruturas mineralizadas
Controlo 5 M Arcos branquiais Cavidade abdominal Controlo: Deposição de cálcio na matriz cartilagínea extracelular Concentração de 5 M de citral: Deposição de cálcio na periferia da cartilagem Deposição de cálcio na cavidade do pericárdio
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Locais de expressão da MGP através de hibridação in situ
Controlo 5M Boca Cabeça e arcos branquiais Trabécula Controlo: Expressão localizada nos condrócitos maturos e hipertróficos 5 M: Expressão localizada nos condrócitos maturos Matriz extracelular de maiores dimensões
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Histopatologia Intestino Controlo 5 M Controlo: Concentração de 5 M:
Vilosidades intestinais com enterócitos de núcleo basal (células sanguíneas junto à parede do intestino) Citoplasma ligeiramente granular Concentração de 5 M: Grande acumulação de pigmento nos enterócitos na zona apical Estreitamento do epitélio intestinal
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Fígado Controlo 5 M 20 M Histopatologia Controlo:
Hepatócitos com núcleos picnóticos com reduzido tamanho celular Controlo: Hepatócitos poligonais, com citoplasma ligeiramente granular Concentração de 5 M: Desorganização do parênquima hepático
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Rim Controlo 5 M Histopatologia Concentração de 5 M:
Grande dilatação do lúmen Forte estreitamento das células epiteliais Resultados semelhantes aos obtidos por outros autores com: Insecticidas Hidrocarbonetos aromáticos
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Desenvolvimento esquelético
Complexo caudal Hipurais Vertebras pré-urais Cartilagem de Meckel BOP (processo basi-occipital) Opérculo Cleithrum
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Deformações esqueléticas
Complexo caudal Pré-ural Hipural
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Deformações esqueléticas
Encurvamento da coluna Complexo caudal Inibição da calcificação Deformações – Concentrações 5 mM e 10 mM Inibição do desenvolvimento – 20 mm
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Considerações finais Alterações: Deformações (aumento):
Desenvolvimento Estruturas ósseas Comportamento (Movimento natatório) Deformações (aumento): Coluna vertebral Complexo caudal Hipurais Vertebras pré-urais
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Deposição de cálcio na zona do coração
Considerações finais Anomalias: Figado Rim Intestino Deposição de cálcio na zona do coração Efeito tóxico em larvas sujeitas a concentrações mais elevadas de citral – 10 M e 20 M
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Futuramente… Realização de mais amostragem utilizando concentrações menores de citral Tratamento utilizando embriões em fases menos desenvolvidas
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Agradecimentos Professora Doutora Leonor Cancela
Paulo Gavaia Quem auxiliou a Susana Carla Viegas no desenrolar deste Juan Bosco projecto. Sandra Marques
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O nosso principal agradecimento
Susana Domingues
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