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Proteínas Recombinantes Histórico e vantagens. Origem • 1944 - Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA. • 1961- François Jacob e Jacques Monod:

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1 Proteínas Recombinantes Histórico e vantagens

2 Origem • Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA. • François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica apartir do DNA. • Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais organismos diferentes. • Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith: Enzimas de restrição (Nobel)

3 Sistemas de Expressão

4 Desvantagem: Produz muitas proteases!!

5 Sistemas de Expressão

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8 Impacto das P.Rs no desenvolvimento de vacinas 17 vacinas em 137 anos. 31 vacinas em 40 anos

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10 Objetivo: • Estabelecer uma abordagem eficiente frente a proteínas de difícil expressão utilizando E.coli. • Para estabelecer uma estratégia 71 proteínas foram escolhidas e cada uma expressa em 15 formas diferentes: (cepa x temperatura x plasmídeos x estresse)

11 Cepas de E.coli • BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease • BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs. • BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana). • BL21-V2R1 pRARE2: introdução do plasmídeo pRARE2 que fornece tRNAs. • BL21-Rosetta: códons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol. • ArcticExpress: contém chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento metabólico de 4° a 12°C. • JM109: mutações em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmídeos. • W3110: mutação no gene gatA que responsável pela metabolização do C.

12 Plasmídeos 6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.

13 Purificação • Os lisados e sobrenadantes são incubados com beads NI-NTA. • A avaliação da expressão é feita por SDS-PAGE.

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