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ESTUDO DA DETECÇÃO DO DNA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL Doutoranda:Rosilene.

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1 ESTUDO DA DETECÇÃO DO DNA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL Doutoranda:Rosilene Calazans Soares Orientador: Prof. Titular Dr. Leão Pereira Pinto UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

2 INTRODUÇÃO

3 REVISÃO DA LITERATURA • Carcinoma epidermóide oral –Aspectos gerais –Etiologia • Papilomavírus humano (HPV) –130 tipos já identificados –Regiões do genoma –Transformação celular: • Proteína E6 + p53 • Proteína E7 + pRb –Classificação: • Grupos clínicos patológicos • Grau de risco para transformação maligna -Zur Hausen et al. (1996) -Pereyra, Guerra, Villa (1997) -Iamaroon et al. (2004)

4 REVISÃO DA LITERATURA • Ciclo celular – CDKs, CKIs, ciclinas – p21: membro da família dos CKIs – pRb: gene supressor tumoral – p21 x pRb – Estudos imuno-histoquímicos em CEO -Regezi et al. (1999) -Nakahara et al. (2000) -Piattelli et al. (2002) -Shintani et al. (2002)

5 REVISÃO DA LITERATURA  ESTUDOS DO HPV EM CEO • Miguel et al. (1998): –45 amostras de CECP (21 de CEO) –5/45 (11%) HPV+ (1 caso de CEO) • Summersgill et al. (2000): –58/202 (28,7%) amostras HPV+ • Chen et al. (2002): –24/29 (85,7%) amostras HPV+ • Ha et al. (2002): –1/34 (2,9%) amostras HPV+ • Sugiyama et al. (2003): –30/86 (35%) amostras HPV+

6 REVISÃO DA LITERATURA • Correnti et al. (2004): –8/16 (50%) amostras HPV+ • Braakhuis et al. (2004): –12/106 (11,3%) amostras HPV+ • Ibieta et al. (2005): –21/50 (42%) amostras HPV+ • Azzimonti et al. (2004): –pRb x CECP x HPV –21/36 (58,3%) amostras HPV+ –28/36 (77,7%) pRb+ (Imuno-histoquímica) –pRB x HPV: 21 HPV+/18 pRb+ e 15 HPV-/10 pRb+

7 PROPOSIÇÃO Diante da possibilidade de relação do HPV com o CEO nos propomos investigar o DNA do HPV nessa lesão, com o intuito de obter-se informações inerentes ao comportamento biológico do CEO. Além disso, pretendeu-se realizar uma análise comparativa entre os grupos de CEO HPV+ e HPV-, empregando-se marcadores do ciclo celular, a fim de estabelecer possível correlação entre a expressão IHQ dessas proteínas e a infecção pelo HPV em carcinoma epidermóide oral.

8 MATERIAL E MÉTODOS • Caracterização do estudo • População • Amostra –Tecido emblocado em parafina de 90 espécimes de CEO –Critério de inclusão • Estudo morfológico • Extração do DNA –Técnica do acetato de amônia-isopropanol • Reação em cadeia da polimerase (PCR): –Utilizando o par de primers PCO3+/PCO4+ –Utilizando o par de primers GP5+/GP6+

9 MATERIAL E MÉTODOS • Eletroforese em gel de agarose e marcação pelo brometo de etídio • Tipagem para HPVs por hibridização dot blot –Sondas radioativas para 19 tipos de HPVs • Estudo imuno-histoquímico –Técnica da estreptoavidina-biotina –Análise do perfil imuno-histoquímico • Análise estatística • Implicações éticas

10 RESULTADOS E DISCUSSÃO • PCR para β-globina (Figura 1) (Figura 1) (Figura 1) • PCR para HPV –26 (29,5%) de 88 CEOs foram HPV+ (Figura 2) (Figura 2) (Figura 2)  Difícil comparação entre resultados da literatura (parâmetros variados).  A infecção pelo vírus pode ser transitória.  Os resultados não fornecem dados sobre uma relação causal. -Saranath et al. (1999) -Summersgill et al. (2000) -Scully. (2002) -Sugiyama et al. (2003)

11 RESULTADOS E DISCUSSÃO • Não houve associação entre o HPV e o sexo dos pacientes. (Tabela 1) (Tabela 1) (Tabela 1) –Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. (2002); Zhang et al. (2004); Correnti et al. (2004). • Não houve associação entre o HPV e a idade dos pacientes. (Tabela 2) (Tabela 2) (Tabela 2) –D’Costa et al. (1998); Bouda et al. (2000); Giovanelli et al. (2002); Zhang et al. (2004). • Não houve associação entre o HPV e a localização anatômica da lesão. (Tabela 1) (Tabela 1) (Tabela 1) –Zhang et al. (2004); D’Costa et al. (1998); Schwartz et al. (2001); Premoli-de-Percoco et al. (2001); Sugiyama et al. (2003).

12 RESULTADOS E DISCUSSÃO • Tipagem para HPVs por hibridização dot blot –Apenas os HPVs 16 e 18 foram detectados, obtendo-se uma maior prevalência do HPV18. –Resultados de acordo com os de Shima et al. (2000), Giovanelli et al. (2002) e Lo Muzio et al. (2004), porém discordam com Chen et al., (2002), Tang et al. (2003), Zhang et al. (2004), Ibieta et al. (2005) que detectaram o HPV16 como o tipo de maior prevalência.

13 RESULTADOS E DISCUSSÃO • Expressão IHQ das proteínas p21 e pRb: –24/33 (72,72%) CEO (+) para pRb (Figuras 3 e 4) (Figuras 3 e 4) (Figuras 3 e 4) –11/33 (33,33%) CEOs (+) para p21 (Figuras 5 e 6) (Figuras 5 e 6) (Figuras 5 e 6) • Não houve associação entre a expressão IHQ de p21 e o HPV (Tabela 3) (Tabela 3) (Tabela 3) –Proteína E7 do HPV-16: bloqueio das funções inibitórias de p21, desde que não esteja mutada. (Cho et al., 2002; Helt, Funk, Galloway, 2002).

14 RESULTADOS E DISCUSSÃO • Observou-se maior expressão IHQ de pRb nos CEOs HPV positivos. (Tabela 2) (Tabela 2) (Tabela 2) –A ligação de E7 do HPV à proteína pRb pode induzir um acúmulo de pRb, denotando assim sua forma inativa.

15 CONCLUSÕES • O baixo percentual de detecção do HPV (29,5%) no CEO sugere que em apenas um subgrupo de lesões, o HPV pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do CEO; • O HPV 18 foi o tipo de maior prevalência, sugerindo que esse tipo, especificamente, está relacionado com o CEO; • Não houve associação significativa entre a presença do HPV e idade e sexo dos pacientes, bem como não houve uma relação entre a detecção do DNA viral e localização anatômica do CEO; • A expressão IHQ de pRb foi significativamente maior nos CEOs HPV positivos que nos HPV negativos, sugerindo uma relação importante entre o HPV e a proteína pRb no CEO; • Não houve diferença na expressão IHQ de p21 nos CEOs positivos e negativos para o HPV, provavelmente, a infecção pelo HPV e a proteína p21 atuam independentemente no desenvolvimento do CEO.

16 “ –...E quando o Reino Divino estiver às portas dos homens, a alma do mundo estará renovada: O mais PODEROSO não será o mais desapiedado e, sim, o que mais ame. O VENCEDOR não será aquele que guerrear o inimigo exterior até a morte em rios de sangue, mas o que combater a iniqüidade e a ignorância, dentro de si mesmo, até a extinção do mal, nos círculos da própria natureza. O mais NOBRE não será o detentor do maior número de títulos que lhe conferem a transitória dominação em propriedades efêmeras da Terra, mas aquele que acumular mais intensamente, os créditos do amor e da gratidão nos corações das mães e das crianças, dos velhos e dos enfermos, dos homens leais e honestos, operosos e dignos, humildes e generosos. O mais SANTO não será o que se isola em altares do supremo orgulho espiritual, evitando o contato dos que padecem, por temer a degradação e a imundície, mas, sim, aquele que descer da própria grandeza, estendendo mãos fraternas aos miseráveis e sofredores, elevando-lhe a alma dilacerada aos planos da alegria e do entendimento. O mais PURO não será o que foge ao intercâmbio com os maus e criminosos confessos, mas aquele que se mergulha no lodo para salvar os irmãos decaídos, sem contaminar-se. O mais SÁBIO não será o possuidor de mais livros e teorias, mas justamente aquele que embora saiba pouco, procura acender uma luz nas sombras que ainda envolvem o irmão mais próximo...” Do livro “Jesus no lar”, de Francisco Cândido Xavier

17 Tabela 1 – Dados clínicos referentes ao sexo e localização anatômica relacionados à presença do HPV e valor de p. Natal/RN, •Teste do qui-quadrado •Lábio, mucosa jugal, palato, trígono retromolar erebordo alveolar

18 Tabela 2 – Dados referentes à idade e expressão imuno- histoquímica para pRb em casos positivos e negativos para o HPV. Natal/RN, •Teste “t” de student

19 Tabela 3 – Expressão imuno-histoquímica da proteína p21 relacionada à presença do HPV. Natal/RN, •Teste de Mann-Whitney

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22 Tabela 2 – Dados referentes à idade e expressão imuno- histoquímica para pRb em casos positivos e negativos para o HPV. Natal/RN, •Teste “t” de student


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