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Coordenadora de estágio: Margarida Santana Francisco Pascoal Ana Coelho Sara Medinas.

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1 Coordenadora de estágio: Margarida Santana Francisco Pascoal Ana Coelho Sara Medinas

2 DNA  Constituído por duas cadeias de nucleótidos;  Cada nucleótido tem uma pentose, uma base fosfato, e uma base azotada;  Todos os nucleótido são essencialmente iguais, variando apenas a base azotada. A - Introdução

3 DNA  As duas cadeias formam uma dupla hélice e têm sentidos opostos, como está evidenciado na figura.  Os nucleótidos das cadeias ligam-se através das bases azotadas. Adenina(A)-Timina(T) Guanina(G)- Citosina (C)

4 DNA  As ligações G-C são triplas (mais fortes)  As ligações A-T são duplas (mais fracas)

5 Bactérias Legenda: 1. DNA cromossómico; 2. Plasmídeos; 16s rDNA O genoma bacteriano é constituído por cromossoma e plasmídeo, o DNA codificante do RNA ribossomal (16s rDNA) está no cromossoma

6 Replicação do DNA é semi-conservativa

7 O PCR imita a replicação do DNA O que é necessário para o PCR?  DNTP (nucleótidos no meio de reacção);  Iniciadores;  Enzima (DNA polimerase termo estável, isolada a partir de uma bactéria termofilica);  Tampão com magnésio.

8  Após a primeira replicação cada molécula de DNA origina duas moléculas.  Consequentemente, a quantidade de moléculas formadas será 2ⁿ, sendo n o número de replicações.  Com este processo e a partir de pequenas quantidades de DNA, obtemos grandes quantidades – amplificação.

9 1 2 Legenda: 1.Iniciador 2.DNTP Nota:  São necessários dois iniciadores, um “forward“ e um “reverse”.  Os iniciadores a utilizar dependem da parte que se quer amplificar.  No nosso caso, utilizámos o P341 F-GC e P518 R, que são primers universais bacterianos.

10 1.Desnaturação de DNA a alta temperatura (95ºC); 2.Descida de temperatura para os iniciadores se unirem à cadeia; 3.Subida à temperatura optima de extensão da DNA polimerase; 1,2 e 3, constituem um ciclo que é repetido 35 vezes.

11 DGGE No final do PCR obtemos um único fragmento, mas que corresponde a uma enorme quantidade de DNA de diferentes microrganismos. Para os podermos separar usamos o DGGE Como funciona? Temos um gel com um gradiente de concentração de ureia, (maior concentração em baixo do gel.) A ureia vai desnaturar o DNA. Como temos diferentes sequencias de DNA, umas com mais G-C do que outros, estas vão oferecer maior resistência à desnaturação do que as ricas em A-T. As moléculas mais ricas em G-C migram mais, só desnaturando na zona do gel com mais ureia.

12 Micro pipetas Para pipetar pequenos volumes, as micro pipetas são um utensílio fundamental, que tivemos de aprender a utilizar correctamente. B – Material e métodos

13 Verificação do DNA Em 1 está colocado um gel de agarose, ligado a uma fonte de alimentação. No gel colocámos as amostras de DNA recolhido. O DNA migra do pólo negativo para o positivo, separando-se de acordo com o seu tamanho. 1 Como vamos ver as bandas de DNA? Usamos Brometo de Etidio, que se intercala no DNA e é visível sob UV.

14 Corrida do gel

15 Para evitar contaminações as reacções de PCR são preparadas numa câmara previamente tratada com UV.

16 Após a preparação das soluções, fizemos o PCR no termociclador.

17 Preparação dos géis para o DGGE 1.Placa de agitação 2.Agitadores magnéticos 3.Gradientador: dois tubos que levam soluções com diferente concentração de ureia. 4. Bomba peristáltica Em 6 temos placas de vidro, onde é depositado o gel, que deriva do gradientador.

18 Tina de eletroforece Aqui é colocado o gel

19 C- Resultados Marcador; 2.Amostra B (sem manganésio); 3.Amostra M (com manganésio); Por comparação com o marcador, podemos inferir que a amostra B tem menos concentração do que a amostra M. 3

20 Após o PCR vêm-se bandas da região amplificada, correspondente a um fragmento de cerca de 200 Pb. De novo, percebe-se que há mais concentração de amostra B do que de M. 200pb

21 Marcador B Sem manganésio Migração dos fragmentos em DGGE M Com magnésio

22 D- Discussão É difícil visualizar as bandas da amostra B, muito provavelmente devido à quantidade de DNA presente. A banda assinalada na foto anterior não existe em B e poderá corresponder a um organismo que se adapta melhor a solos ricos em manganésio

23 Também se conclui que temos poucos microrganismos, ou seja, pouca diversidade; o gel ao lado é exemplo dos muitos microrganismos esperados em solos “saudáveis”


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