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Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratament Diagnóstico laboratorial.

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1 Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratament Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento Marluce Aparecida Assunção Oliveira Bióloga, Especialista em Microbiolgia Especialista em Gestão Institucional - MBA Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas Fundação Ezequiel Dias - LACEN/MG

2 Antígenos versus Anticorpos Leptospira spp.

3 Sorovar específica Resposta predominantemente humoral (anticorpos). Antigenicidade Antigenicidade Atígenos de superfície (LPS); Compartilhamento de antígenos. Resposta imune a Leptospira spp. Resposta imune a Leptospira spp. -

4 Bacteriuria ImunidadeBacteremia Fases Diagnóstico sorológico IgG IgM Concentração de anticorpos anosmeses 4 0 semana 3 0 semana 2 0 semana 1 0 semana Escala de tempo Evolução da resposta humoral (anticorpos) Isolamento e PCR ( adap. Royal Tropical Institute, Netherlands)

5 Diagnóstico Laboratorial 1ª fase da doença ou fase leptospirêmica 1ª fase da doença ou fase leptospirêmica ( dias). Cultivo. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 2ª fase da doença ou fase imunogênica 2ª fase da doença ou fase imunogênica ( dias). Pesquisa em campo escuro. MAT (Teste de aglutinação microscópica). ELISA (Ensaio imunoenzimático). PCR (Reação em cadeia da polimerase).

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7 Cultura de Leptospira spp. O isolamento de leptospiras depende do material biológico de escolha e do tempo de evolução da doença.

8 Cultivo de Leptospira spp. Meio semi-sólido Meio líquido

9 Hemocultura Hemocultura Exame qualitativo Fase de leptospiremia: primeiros 10 dias de doença  antes do início da antibióticoterapia; Coleta em condições assépticas; 1,2 e 3 gotas de sangue total em três respectivos tubos; Incubação o C / abrigo da luz / aprox. 4 meses; Acompanhamento semanal por microscopia de campo escuro. 5 mL meio de cultura semi sólido

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11 Sorovares e cepas - Microaglutinação. Meio líquido

12 Triagem - Exame qualitativo Triagem - Exame qualitativo. Leitura após incubação. Preparo da lâmina para visualização das reações de cada sorovar/paciente Leitura microscópica

13 Visualização microscópica Sem aglutinação25% aglutinado50% aglutinado 75% aglutinado100% aglutinado Microscopia de campo escuro (leitura): Microscopia de campo escuro (leitura):

14 Titulação - Exame quantitativo Soro 1709 CN = 100  l PBS + sorovar a ser titulado. 100  l soro diluído 1:  l sorovar a ser titulado. CN 100  L 1:  L Hardjo Icteroh. Autum. Patoc Wolffi Astralis Canic. Taras. 1:100, 1:200, 1:

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16 Fase sólida com antígeno ou anticorpo mobilizado; conjugado (ante imunoglobulina humana ligado a uma enzima); adição do substrato; formação de cor; leitura por espectrofotometria (determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade do que está sendo medido). ELISA-IgM para o diagnóstico de leptospira

17 ELISA - exame qualitativo

18 Perfil de reatividade - MAT e ELISA-IgM  Numero de soros positivos/ ,4% 36,1% 22,3% 17,2% 7,8% 2,2%

19 ELISA - IgM reagente e MAT ≥ 800. ELISA - IgM reagente e MAT reagente ≤ 800. ELISA - IgM reagente. ELISA indeterminada e MAT reagente ≤ 800. ELISA indeterminada. ELISA - IgM não reagente e MAT reagente ≤ 800 (IgM e IgG). Perfil de reatividade

20 ELISA IgM Sensibilidade 100% ELISA IgM Especificidade 86 % ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 71% ELISA IgM Valor Preditivo Negativo 100% MAT (Padrão ouro) ELISA - IgM MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM

21 ELISA IgM Sensibilidade 99,5% (IC 95% 98,0-100,0%) ELISA IgM Especificidade 90,0% (IC 95% 88,5-91,5) ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 74,5% (IC 95% 66,7-80,9%) ELISA IgM Valor Preditivo Negativo 99,8% (IC 95% 99,1-100%) MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM Concordância 92,3% (IC95% 89,6-94,4%). Concordância 92,3% (IC95% 89,6-94,4%).

22 Amostras com diagnóstico diferencial

23 N= 127 (R-11; I-2; NR-114)

24 INDOCOELISAMATDF 90,4290,261REAGENTE andamana1/200; ballum1/100; shermani1/400; tarassovi1/400; FEBRE MACULOSA IgM: IFI REAGENTE 30,6360,224REAGENTE andamana1/200; australis1/100; ballum1/100; bratislava1/100; sejroe1/100; hardjo1/100; icterohaemorrhagiae1/100; patoc1/100; tarassovi1/800 HEPATITE C (ANTI- HCV): ELISA REAGENTE 230,1830,163REAGENTENÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI REAGENTE 140,2990,163REAGENTENÃO REAGENTE FEBRE MACULOSA IgG: IFI REAGENTE 90,20,163REAGENTENÃO REAGENTELEISHMANIOSE VISCERAL : IFI REAGENTE IN: curso da doença; DO: leitura do teste; CO ponto de corte; DF: diagnóstico diferencial. ELISA- IgM BIOMANGUINHOS x MAT

25 Conclusões Baseado no VPN : o método de ELISA - IgM é um bom método para triagem de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose diminuindo assim o número de amostras examinadas pelo método de microaglutinação. É necessário a realização da microaglutinação para todas as amostras que apresentarem resultados indeterminado ou reagente na ELISA - IgM. Quando expandido o intervalo entre inicio de sintomas e data de coleta, verificamos maior sensibilidade da ELISA - IgM, assim, todo amostra coletada antes de 10 dias de curso da doença deverá ser encaminhada 2ª amostra após uma semana da data da coleta da 1ª.

26 - Todas as amostras (soro) de pacientes com suspeitas de leptospirose são analisadas (triadas) pelo método ELISA-IgM. -Somente as amostras (soro) que apresentarem resultados indeterminado ou reagente quando analisadas pelo método de ELISA-IgM serão analisadas pelo método de Aglutinação Microscópica (MAT). -Amostras (soro) de pacientes com um mês ou mais de início de sintomas serão processadas as duas metodologias, ELISA-IgM e MAT. Diagnóstico de Leptospirose - Lacen MG (desde 2011)

27 - Todos os laudos que apresentarem resultados não reagente para leptospirose constarão apenas a descrição do resultado do ELISA-IgM, os que apresentarem resultados indeterminados ou reagente pelo método de ELISA-IgM constarão da descrição dos resultados do ELISA-IgM e MAT. -Todas as amostras (soro) devem ser encaminhadas juntamente com a ficha SINAN, e a data de coleta e início de sintomas são informações fundamentais para a análise dos resultados laboratoriais, portanto, de preenchimento obrigatório. Diagnóstico de Leptospirose (desde 2011) Sempre que possível ofereça flores. Obrigada


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