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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais BIOMEDICINA FIEL DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO.

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1 ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais BIOMEDICINA FIEL DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO

2 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações imunoquímicas Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de antígeno a ser pesquisado)) Superfície da célula Disperso em solução Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Afinidade Avidez Diversidade

3 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Classificação dos Imunoensaios

4 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Precipitação QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio. Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos componentes: FENÔMENO PR0-ZONA Desnecessária separação do complexo antígeno+anticorpo (fase ligada) das substâncias livres no meio COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode ser quantificado: visualmente a olho nu visualmente usando um microscópio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometria

5 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Precipitação Fatores interferentes: Concentrações do antígeno e do anticorpo presentes no “sistema” (amostra+reagente) Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) Precipitação máxima: concentrações equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac) Sensibilidade: 10 microgramas/mL

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8 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Precipitação Direta Clássica triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES VDRL – V enereal D esease R esearch L aboratory RPR – R eagina P lasmática R ápida RPS - R eagina P ara S ífilis medido nestas reações: presença de anticorpos para o material lipoproteico das células danificadas pela doença. presença de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOS Sensibilidade: 78% na fase primária (74 a 87%) 100% na fase secundária 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)

9 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Precipitação DERIVADAS MANUAIS Imunodifusão Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixação Eletroimunodifusáo UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA AUTOMATIZADAS NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS

10 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Nefelometria e Turbidimetria Possibilidade de Automação total Nefelômetros Equipamentos de bioquímica (turbidimetria) Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) Fator Reumatóide Microalbumina Proteína C Reativa Apoliproproteína inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas, transferrina etc)

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13 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Aglutinação Formação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículas Detectam tanto a presença de IgM quanto de IgG Visualização: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:

14 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Reações de Aglutinação Fatores interferentes: Classe do Anticorpo envolvido; Eletrólitos; Macromoléculas Hidrofílicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; Temperatura

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16 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Falso Negativas Quantidade pequena de anticorpos: a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando; Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)

17 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS 1. Determinantes antigênicos Naturais: Eritrócitos humanos – determinação grupo sangüíneo ABO Bactérias – SLIDEX meningites Protozoários 2. Partículas inertes revestidas Látex (mais comum) – teste de gravidez Gelatina Betonita, polipeptídeos 3. Células antigenicamente não relacionadas Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados Hemácias e bactérias

18 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas Aglutinação direta : ex teste de gravidez Aglutinação passiva Hemaglutinação direta: ABO RH Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose Hemaglutinação Passiva Inibição de Hemaglutinação Inibição de Hemaglutinação passiva

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21 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Imunofluorescência Manual 1 Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno. Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato de Fluoresceína* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)

22 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Imunofluorescência Manual 2 - DIRETA A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência Pesquisa de antígeno amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)* microscópio de fluorescência

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24 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Imunofluorescência Manual 3 – IFI - INDIRETA A- pesquisa de antígeno amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscópio de fluorescência * lavagens B- pesquisa de anticorpos Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscópio de fluorescência determinação do título e classe do Ac

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27 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificação tipo de reação (cinética) COMPETITIVOS Há competição entre a substância presente na amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA). NÃO COMPETITIVOS: São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico

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29 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Competitivo ou não Competitivo: Quanto maior a concentração do analito menor a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut- off” Não Competitivo Quanto maior a concentração do analito maior a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut- off”

30 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: COMPETITIVOS anticorpo primário na fase sólida – (pag 963) e antígeno marcado secundário anticorpo secundário na fase sólida – (pag 964) e antígeno marcado NÃO COMPETITIVOS SEQUENCIAL SANDUÍCHE

31 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiométrico (IRMA) Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimático MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas Marcador FLUORESCENTE Imunofluorométrico (IFMA) FPIA – Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescência convencional EQL, Eletroquimioluminescência (ECLIA) Ensaio imunológico quimioluminescente magnético CMIA

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33 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: Fatores Interferentes: Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais. Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais

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35 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS Fatores interferentes II Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.

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37 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Ensaios com marcadores RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em São Paulo) um dos componentes do sistema é marcado com isótopo radioativo ensaios competitivos : o reagente marcado é = à substância que se quer dosar (antígeno) (RIA/RIE) ensaios não competitivos: o reagente marcado é um segundo anticorpo (IRMA) O radioisótopo mais utilizado é o I 125 (57,5 dias)

38 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Ensaios com marcadores ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA EIA – Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático ELISA - E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay MEIA – M icroparticule E nzyme I mmuno A ssay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas ELFA – E nzyme- L inked F luorescent A ssay: Ensaio imuno-enzimático fluorescente

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40 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO ETAPAS ELISA, EIA sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Ac bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * adição da amostra (em diluente) * adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupção da reação: SDS ou ácido forte leitura: leitor de ELISA * lavagens

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43 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO EIA – ELISA Vantagens e Desvantagens Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica; Cuidados com interferentes, reações cruzadas Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variáveis analíticas Adaptação a diferentes graus de automação Instabilidade dos reagentes Influência em manipulações e do equipamento

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46 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Ensaios com marcadores FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA MEIA – M icroparticule E nzyme I mmuno A ssay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente – Axsym) (ABBOTT) ELFA – E nzyme- L inked F luorescent A ssay: Ensaio imuno- enzimático fluorescente IFMA : I mmuno F luoro M etric A ssay ou ensaio Imunofluorométrico FPIA: F luorescence P olarization I mmuno A ssay

47 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO Ensaios com marcadores FLUORESCENTES Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes Utilizam aparelhos denominados de Fluorômetros; As técnicas diferem quanto ao suporte sólido As técnicas diferem também á forma de ampliar o sinal; Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA Possui sensibilidade e especificidades elevadas; Bom método para dosagens hormonais

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49 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO QUIMIOLUMINESCÊNCIA I Reação entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instável o qual após estabilização gera emissão de fótons de luz medida por FM, que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos(CPS). São reações de oxidação ►luz no espectro visível;

50 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO QUIMIOLUMINESCÊNCIA II A sensibilidade de um método enzimático aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente; É a emissão de luz produzida em algumas reações químicas envolvendo moléculas que emitem luz, quando passam do estado de excitação para o basal eletrônico; São altamente sensíveis; Método de escolha para quantificação de substâncias, como hormônios e marcadores tumorais.

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56 DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO QUIMIOLUMINESCÊNCIA Pra que serve??? Qual vantagem? 1. UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) HORMÔNIOS DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTEÍNA 2. VANTAGENS: Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente


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