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Prof. Adriane Martins Dias.  Muitas técnicas de laboratório baseiam-se no uso de anticorpos.  O método laboratorial que utiliza anticorpos têm grande.

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1 Prof. Adriane Martins Dias

2  Muitas técnicas de laboratório baseiam-se no uso de anticorpos.  O método laboratorial que utiliza anticorpos têm grande importância por ser possível produzir anticorpos contra qualquer tipo de molécula e composto químico.

3  Principais técnicas que utilizam anticorpos para identificação clínica:  A) Imunoensaios ◦ Radioimunoensaios e Ensaio de imunoabsorção por Ligação Enzimática.  B)Purificação e Identificação de Proteínas ◦ Imunoprecipitação e Cromatografia por afinidade. ◦ Western Blot

4  C) Marcação e Detecção de Antígenos em células/tecido ◦ Citometria de Fluxo ◦ Imunoflorescência e Imuno-histoquímica  D) Medição de Interação Antígeno/Anticorpo  E) Técnicas que fazem análise da estrutura e da expressão gênica. ◦ PCR

5  Imunofluorescência:  Primeira técnica utilizada foi a Imunofluorescência Direta. Nesta técnica se pesquisa um antígeno em uma reação com anticorpo preparado com fluorocromo.  São utilizados anticorpos purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo.

6  Imunofluorescência Direta

7  É chamada de técnica de camada simples.  Imunofluorescência Indireta (dupla camada):  Antígenos são fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente e por isso coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno.

8  Nesta técnica pode-se trabalhar com vários anticorpos primários para diferentes tipos de antígenos.  Nesta técnica o antígeno fica entre dois anticorpos.  Técnica é aplicada para estudar tecidos linfoides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido.

9 Imunofluorescência Indireta

10  Imunoenzimático: ELISA  Se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima. Essa enzima irá agir sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor.  Produto da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir no local da formação.

11 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) – Ensaio de Imunoabsorção ligado a enzima)

12  Reação é desenvolvida, frequentemente, em microplacas contendo vários poços onde são depositados os reagentes.  Método Direto ou Sanduiche  Usado para identificação de antígenos, e esse antígeno fica entre dois anticorpos.  O anticorpo de um antígeno particular é inicialmente adsorvido a placa.

13  Posteriormente o antígeno (soro, urina ou solução contendo o antígeno), é adicionado, e se liga ao anticorpo.  Seguidamente um segundo e diferente anticorpo ligado a enzima é adicionado.  A intensidade da reação é proporcional a quantidade de antígeno presente, permitindo se mensurar até pequenas quantidades de antígeno.

14  ELISA (Método Indireto) – Utilizado para detecção de anticorpos.  O antígeno fica aderido aos poços da microplaca.  Em seguida, coloca-se o soro problema e posteriormente um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor.

15  A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor confirma a ausência do anticorpo em questão.  Enzimas:  São elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor.  Enzima mais utilizada é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento de H2O2 em H2O mais O2.

16  Interpretação dos resultados:  A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presentes no soro.  A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro (Leitor de Elisa) permitindo uma análise quantitativa.

17  ELISA ( Método Indireto)

18  ELISA

19  Radioimunoensaio:  Pequenas quantidades de anticorpos ou antígenos podem ser detectadas depois de marcadas com isótopos radioativos.  É uma reação de imunológica onde temos um aumento da especificidade.  Não ocorre perda de características físicas, químicas e biológicas das moléculas marcadas com os compostos radioativos.

20  Citometria de Fluxo:  É uma técnica que tem como particularidade a análise rápida, quantitativa e multiparamétrica de uma célula individual (viva ou morta), entre diversas células de uma população.  É frequentemente empregado para investigar a expressão de certas moléculas intracelulares ou moléculas de membrana.

21  São utilizados anticorpos marcados com fluorocromo e a análise dos parâmetros é mensurada por meio da intensidade de fluorescência produzida por esses marcadores.

22  Citômetro

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