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Ano Lectivo 2013/2014 Licenciatura em Biologia Humana Biologia do Desenvolvimento Docente: Professor Doutor Paulo de Oliveira Discentes: Bárbara Correia,

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1 Ano Lectivo 2013/2014 Licenciatura em Biologia Humana Biologia do Desenvolvimento Docente: Professor Doutor Paulo de Oliveira Discentes: Bárbara Correia, Beatriz Martinez, 30181

2 O PÂNCREAS O pâncreas desenvolve-se a partir de duas glândulas na endoderme do primórdio do sistema digestivo superior. Vida Endócrina ●Células α - produtoras de glucagina ●Células β - produtoras de insulina ●Células δ - produtoras de somatostanina ●Células PP - produtoras de polipétidos pancreáticos Vida Exócrina Ácinos - produtores de enzimas digestivas

3 O PDX1 e seus associados no desenvolvimento do pâncreas

4 O QUE É O PDX1? Gene codificador de um fator de transcrição É um regionalizador do pâncreas e essencial na sinalização do seu desenvolvimento normal Deficiência neste gene dão origem a várias patologias A ablação do PDX1 origina agénese pancreática

5 Indutores da expressão do PDX1 RBÁREASGATASIRT IFOXA

6 RB - Proteína do riboblastoma

7 ENHANCERS I, II, III E IV Enhancers do gene PDX1 onde se ligam os FOXA. O enhancer IV é um enhancer mais distante, capaz de dirigir a expressão do gene reporter das células B. Deleção dos enhancers I, II e III causa hipoplasia pancreática. Os enhancers I e II parecem actuar juntas para optimizar a expressão de PDX1 nas celulas β.

8 FOXA1 e FOXA2 Co-ocupam múltiplos domínios regulatórios no gene PDX1 Ablação destes fatores de transcrição resulta na perda de expressão do PDX1, um desenvolvimento corrompido dos ilhéus e ácinos bem como morte neonatal Estes enhancers são suficientes para dirigir a expressão do PDX1 e restaurar o desenvolvimento do pâncreas e a maturação dos ilhéus. Uma deficiência no FOXA2 resulta na ausência das células α maturas e na redução da expressão do PDX1 e diferenciação das células β Remoção dos dois FOXA, 1 e 2, do primórdio pancreático causa uma agénese total do pâncreas e perda da expressão do PDX1. A expressão do PDX1 nas células endócrinas e exócrinas bem como a sua diferenciação são dependentes dos FOXA

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10 Relação entre os FOXA e os Enhancers

11 SIRT 1

12 GATA 4 e 6 São fatores de transcrição Foram descobertos no enhancer II e são críticos para a organogénese do pâncreas São essenciais para a proliferação, morfogénese, e diferenciação das células progenitoras pancreáticas Mutações nestes FT são a maior causa de agénese pancreática

13 Ativam o PDX1 que por sua vez vai ativar um outro fator de transcrição essencial ao desenvolvimento pancreático A deleção dos locais de ligação dos GATA inibe a ação do reporter na altura do desenvolvimento dos primordios pancreaticos Defeitos morfológicos nos GATA origina uma falha na expansão do epitélio por problemas na proliferação e diferenciação celular Quando há deleção dos dois GATA causa agénese pancreática, nascem com hiperglicémia e morrem pouco depois do parto

14 PCIF1 É uma proteína nuclear que inibe a transativação do PDX1 Contribui diretamente para a acumulação da proteína do PDX1 na célula β adulta PCIF1 marca o PDX1 para ubiquitinação e degradação proteossomal através do Cul-3 Deficiência no PCIF1 aumenta os níveis das proteínas do PDX1 O PCIF1 mutado limita a acumulação do PDX1 nas células β adultas e, consequentemente, a expressão de insulina e outros genes alvo essenciais para a manutenção das células β e sua função. PCIF1-Cul3 como alvo terapêutico pode aumentar as proteínas do PDX1 de modo a melhorar a função das células β tratamento para a diabetes

15 Alvos e co-expressores do PDXI PTF1A NOTCH NGN3 PAX 4 e 6 NKx Maf Mib-1 MNX-1 LBL-11/ISL-1 KRAS miRNA-375 p27 GATA

16 É um fator de transcrição necessário ao desenvolvimento do pâncreas e do sistema nervoso O PTFA1 está envolvido no aumento ou manutençao da expressão do Pdx1 durante o desenvolvimento dos primórdios pancreáticos Durante o desenvolvimento dos ácinos RBPJ é substituído por RPBJL Maturação dos ácinos e manutenção da expressão exócrina O FOXA2 está localizado num local especifico do pancreas com o PTF1A enquanto que os SOX estão no tubo neural dupla função do PTF1A PTF1A

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18 NOTCHNGN3 Regula o destino da célula durante a embriogénese bem como a manutenção do mesmo durante a vida; Perturbações na via do NOTCH resultam numa alteração do destino da célula Na presença do NOTCH há expressão do mRNA HES1 e p48, o que leva as células a adotarem a componente exócrina Perda de função do NOTCH aumenta a expressão do gene NGN3 promovendo um destino endócrino Fator de transcrição essencial uma vez que todas as células progenitoras endócrinas expressam este gene Numa primeira fase a sua expressão resulta na produção de células produtoras de glucagina Numa segunda fase intervêm na diferenciação das celulas endócrinas Na ausência do NGN3 os ratinhos nascem sem ilhéus de Langherhans desenvolvendo diabetes

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20 Pax 4 O PAX4 expressa-se em todas as células progenitoras endócrinas A sua expressão perde-se com a perda do NGN3 Na sua ausência não há desenvolvimento das células β e δ e há uma diminuição da expressão do PDX1

21 NKx São reguladores essenciais ao desenvolvimento do pâncreas NKx2.2 e NKx6.1. estão envolvidos nas linhagens celulares endócrinas O NKx2.2 liga-se aos promotores de insulina e PAX4 Quando perde expressão há uma redução das células β e PP bem como uma perda total das β Na sua ausência as células β não conseguem ativar o gene transcritor da insulina e não há NKx6.1 No adulto a expressão do NKx6.1 está limita às celulas β suprimindo a expressão de glucagina e modula a glicose por secreção de insulina Uma deficiência neste regulador não afeta o desenvolvimento inicial mas há um comprometimento do desenvolvimento das células β

22 Maf A e B - Fatores de transcrição Ratinhos knockout para o MAFA não demonstram alterações no desenvolvimento do pâncreas. Perdem células β e a sua frequência apoptótica está aumentada originando intolerância à glicose e diabetes tipo 2 O MAFA liga-se ao promotor da insulina e através da sua interação com o PDX1 e NEUROD1 ativa a transcrição do gene da insulina O MAFB expressa-se a partir células α onde regula a expressão do gene da glucagina Intervém no desenvolvimento e diferenciação das células α e β por transcrição dos genes O seu papel nas células α vai diminuindo após o nascimento

23 MIB-1 MNX-1 Codifica a ligase E3 da ubiquitina essencial para a atividade ligase do NOTCH requerido para a formação das células β Inativação do MIB-1 redução das células β Fator de transcrição com papel essencial no desenvolvimento e função do pâncreas Suprime o destino das células α nos precussores das células β Na sua ausência não se dá a formação do lobo dorsal Ilhéus de Langherhans mais pequenos com número de células β reduzidas

24 Lbl-11 / Isl-1 KRAS Uma mutação oncogénica no KRAS despoleta a progressão e crescimento de adenocarcinomas no ducto pancreático (PDAC) Provoca: -estimulação da absorção de glicose - diferenciação dos canais intermediarios da glicose - reprogramação do metabolismo da glutamina -aumento da autofagia e macropinocitose Regulador da transcrição expresso no pâncreas em desenvolvimento Envolvido maturação, proliferação e sobrevivência da segunda onda dos ilhéus de Langerhans Regula o MAFA Quando há uma deficiência neste regulador os animais não desenvolvem células β funcionais, têm dificuldade em expandir a sua massa endócrina após o nascimento levando à diabetes.

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26 miRNA-375 p27 Regula a expressão genética por ligação a sequências complementares O miR-375 está presente na célula β e é regulado por vários fatores de transcrição incluindo o PDX1 Sabe-se que miR-375 é essencial para a regulação do desenvolvimento do ducto, das celulas endócrinas e exócrinas. Este regulador do ciclo celular é essencial para o estabelecimento da masa de células β A sua ativação durante a embriogénese resulta num aumento da massa das células β apesar de não afetar a sua expansão pós- natal.

27 CRONOLOGIA DA ORGANOGÉNESE PANCREÁTICA Formação do broto dorsal e ventral.Inicio da formação das celulas endócrinas.Expressão do Ptfa1.Pax 4 mRNA é detectado Sinais da ectoderme e mesoderme Expressão do Pdx1 Pdx1 tem a sua expressão restrita à componente endócrina. 1ªonda incia-se com a formaçao de celulas secretoras de insulina e glacagon.Pdx1 é mediador de sinais mesenquimas Nk6.1 restrito ao epitelio central 12 Ligação do PTFA1 a areá III para desenvolvimentos dos primórdios pancreáticos Expressão de MafB Inicio da expressão do lbl-11/isl-1

28 CRONOLOGIA DA ORGANOGÉNESE PANCREÁTICA ªonda de pdx1 Maior surgimento de celulas β Pdx1 é necessário para a diferenciação do tipo de células 12 Expressão de Ngn3 Decide o que vai para a componente endócrin a.2ªTransição.Pdx1 torna-se restrito para a cel. endócrina.Ptf1a torna-se restrito para a os ácinos.Nkx2.2 torna-se restrito para as celulas endócrinas.Os ácinos e ductos tornam-se histologicamente diferentes.Fusão das 2 ramificações do pâncreas. Os ácinos separam-se do ducto central.Cel. endócrinas formam estruturas tipo ilheu Início da formação dos ilhéus de Langerhans MafA inicia a sua expressão

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30 COMPONENTE ENDÓCRINA

31 NOTCH Envolvido na patologia da diabetes. Ativação do NOTCH exerce um efeito positivo na expressão/ secreção da insulina e proliferação celular por upregulation do PDX1 Quando há bloqueio do NOTCH não se formam as proteínas necessárias o que resulta em sensibilidade à insulina. Um mutante do NOTCH resulta numa resistência intermediária à insulina. O Notch1 como potencial alvo terapeutico Reverter hipoinsulinema através do Notch1 usando uma plataforma de RNAi Reverter a hiper e hipoinsulinemia através de três ciclos de tratamento com PDX1 shRNA. Também reduz o volume de tumores.

32 TUMORES NEUROENDÓCRINOS PANCREÁTICOS (PNETs) O NOTCH1 e o PDX1 estão sobreexpressos em PNETs O HES1, alvo do NOTCH1, também está em expresso em PNETs O NCID também se expressa em correlação com a sobreexpressão do PDX1, estes originam um aumento da proliferação de algumas células β em ratos com insulinoma; O NOTCH1 faz upregulation do PDX1 apresentando um papel oncogénico nos PNETs

33 DIABETES TIPO 2 Em ratinhos com uma dieta baixa em proteínas verificou-se uma redução da expressão da proteína do PDX1 e do seu mRNA Uma exposição a uma dieta rica em gorduras pode alterar a sensibilidade à glicose e os mecanismos de sinalização de insulina A descendência de progenitoras obesas tem uma redução da insulina, glicocinase, GLUT2 e da proteína do PDX1 Alterações destes fatores contribuem para um redução do número de células β Uma desregulação epigenética por alteração do ambiente in-utero aumenta a suscetibilidade à diabetes tipo 2.

34 MATURITY ONSET OF DIABETES OF THE YOUNG, TIPO4 (MODY4) É uma forma da diabetes tipo 2 rara Ligada à subexpressão do PDX1 no pâncreas humano por mutações inativadoras ou missense O PDX1 controla a transcrição da insulina e expressão das enzimas associadas A supressão do PDX1 nas células de insulina não altera o metabolismo da glicose mas inibe a libertação de insulina

35 COMPONENTE EXÓCRINA

36 Metaplasias A desdiferenciação dos ácinos predispõe-nos a uma transformação maligna Quando um ácino passa a célula ductal resulta numa metaplasia, esta resulta num PanIn (neoplasia) e consequente PDAC (adenocarcinoma) A expressão do KRAS juntamente com o NOTCH a partir do PDX1 Cre recombinase provoca lesões PanIN A ativação do AKT usando a Cre recombinase sobre controlo do promotor elastase conduz a metaplasias

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38 KRAS As lesões panIN têm uma levada incidência de mutações KRAS, esta é necessária para a formação do cancro e para a sua progressão e manutenção. Há eventos adicionais que despoletam a formação do cancro, sendo estes genéticos e epigenéticos. Também há fatores de risco como a pancreatite crónica Desativando o KRAS ocorre uma rediferenciação dos PanIns a ácinos e a morte massiva das células epiteliais. Também ocorre um efeito similar nos tumores

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40 INTERAÇÃO DO PDX1 COM OUTRAS VIAS

41 SOX9 E O ADENOCARCINOMA DO DUCTO PANCREÁTICO Ácinos ADM - celulas com Sox9 / Ck19 PanINs PDA Kras Notch

42 Bibliografia ●http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PDX1&search=PDX1http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PDX1&search=PDX1 ●http://omim.org/entry/600733?search=PDX1&highlight=pdx1http://omim.org/entry/600733?search=PDX1&highlight=pdx1 ●Avrahami, D., & Kaestner, K. H. (2012). Epigenetic regulation of pancreas development and function. Semin Cell Dev Biol., 23(6), 693–700. doi: /j.semcdb Epigenetic ●Bernardo, A. S., Cho, C. H.-H., Mason, S., Docherty, H. M., Pedersen, R. a, Vallier, L., & Docherty, K. (2009). Biphasic induction of Pdx1 in mouse and human embryonic stem cells can mimic development of pancreatic beta-cells. Stem Cells (Dayton, Ohio), 27(2), 341–51. doi: /stemcells ●Berneman-Zeitouni, D., Molakandov, K., Elgart, M., Mor, E., Fornoni, A., Domínguez, M. R., … Ferber, S. (2014). The temporal and hierarchical control of transcription factors-induced liver to pancreas transdifferentiation. PloS One, 9(2), e doi: /journal.pone ●Bramswig, N. C., & Kaestner, K. H. (2012). Organogenesis and functional genomics of the endocrine pancreas. Cell Mol Life Sci., 69(13), 2109– doi: /s z.Organogenesis ●Bryant, K. L., Mancias, J. D., Kimmelman, A. C., & Der, C. J. (2014). KRAS: feeding pancreatic cancer proliferation. Trends in Biochemical Sciences, 39(2), 91–100. doi: /j.tibs ●Carrasco, M., Delgado, I., Soria, B., Martín, F., & Rojas, A. (2012). GATA4 and GATA6 control mouse pancreas organogenesis. The Journal of Clinical Investigation, 122(10), 3504–3515. doi: /JCI65751.tional ●Chen, C., Fang, R., Davis, C., Maravelias, C., Sibley, E., Chen, C., … Pdx, S. E. (2009). Pdx1 inactivation restricted to the intestinal epithelium in mice alters duodenal gene expression in enterocytes and enteroendocrine cells, 1126–1137. doi: /ajpgi ●Claiborn, K. C., Sachdeva, M. M., Cannon, C. E., Groff, D. N., Singer, J. D., & Stoffers, D. A. (2010). Pcif1 modulates Pdx1 protein stability and pancreatic β cell function and survival in mice, 120(10), 3713–3721. doi: /JCI40440DS1 ●Collins, M. a, & Pasca di Magliano, M. (2013). Kras as a key oncogene and therapeutic target in pancreatic cancer. Frontiers in Physiology, 4, 407. doi: /fphys ●Eser, S., Reiff, N., Messer, M., Seidler, B., Gottschalk, K., Dobler, M., … Saur, D. (2013). Selective requirement of PI3K/PDK1 signaling for Kras oncogene-driven pancreatic cell plasticity and cancer. Cancer Cell, 23(3), 406–20. doi: /j.ccr

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45 OBRIGADA PELA VOSSA ATENÇÃO!


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