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MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa

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Apresentação em tema: "MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa"— Transcrição da apresentação:

1 MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA FACULDADE DE MEDICINA LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS.   MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa Fortaleza/CE 2014

2 História Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos; Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010) Câncer (Grego - caranguejo) Hipócrates – Grécia Antiga Conjunto de doenças Crescimento desordenado Poder invasivo Câncer é uma palavra comumente utilizada para designar todos os tumores malignos, esta palavra provavelmente é oriunda do latim, cujo significado é caranguejo. Acredita-se que os tumores malignos passaram a ser chamados de câncer em decorrência de uma analogia entre a capacidade de aderência das células neoplásicas e a obstinação de um caranguejo quando se agarra a algo (KUMAR et al., 2004; INCA, 2010).O termo neoplasia significa crescimento novo, já a expressão tumor deve-se a tumefação decorrente da inflamação característica. Foram identificados mais de uma centena de tipos e subtipos de cânceres (LIOTTA & KOHN, 2001; RIBEIRO et al., 2003). (BROWN & ATTARDI, 2005)

3 Câncer 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública
7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo 70 % ocorreram em países de baixa ou média renda Até 2020: Cerca de 15 milhões de novos casos 60 % em países em desenvolvimento Brasil – novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013) Fonte: OMS 2008

4 Brasil Fonte: INCA 2011

5 SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR
Câncer “ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.” ATIVAÇÃO DE ONCOGENES PROGRAMAS CELULARES: PROLIFERAÇÃO MIGRAÇÃO DIFERENCIAÇÃO APOPTOSE ALTERAÇÃO SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR (HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)

6 Carcinogênese Expanção clonal – Dano ao DNA – mutação câncer
Céls. transformadas Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica Agentes Citotóxicos Dano ao DNA Reparação de céls. com menor intensidade proliferativa DNA reparado Mecanismos de morte funcionantes Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005

7 TIPOS DE MORTE CELULAR Catástrofe Mitótica Necrose Autofagia Apoptose
LC3 Autofagia Apoptose PS  Autofagia é um processo celular fisiológico para degradação e reciclagem de componentes do citosol e organelas celulares danificadas, para manutenção da homeostase celular em condições adversas como privação de nutrientes, presença de patógenos e toxinas. Porém, quando o processo ultrapassa um determinado limiar pode levar ao processo de morte autofágica ou morte celular programada tipo II. E este parece ser o mecanismo de ação de algumas drogas utilizadas na prática clínica oncogênica, como a temozolomida e a rapamicina.  A teoria de morte celular programada foi proposto pela primeira vez em 1965 por LOCKSHIN & WILLIAMS (1965). Os eventos de mortes celulares são classificados baseando-se nas suas características morfológicas e bioquímicas. Dentre as formas de morte conhecidas a necrose e a apoptose são dois caminhos bastante conhecidos. A necrose é notadamente identificada após a célula sofrer agressão, neste caso morfologicamente a mesma apresenta um aumento do volume celular, perda de integridade da membrana, cromatina agregada e desorganização celular. Na necrose, em decorrência da perda da integridade da membrana ocorre extravasamento do conteúdo celular, geralmente resultando em danificação de células vizinhas, podendo desencadear uma inflamação local (KUMAR et al., 2004; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004). A apoptose é conhecida como “morte celular programada”, é relativamente fácil de ser identificada morfológicamente. Geralmente a membrana celular permanece íntegra, as organelas com a morfologia preservada, com a exceção da mitocôndria que em algumas situações podem ter sua membrana externa rompida. A cromatina apresenta-se condensada e permanece junta a membrana nuclear. O núcleo se desintegra, formando “corpos apoptóticos”. Estes últimos geralmente são fagocitados por macrófagos antes de provocarem um processo inflamatório (STRASSER et al., 2000; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004).

8 NECROSE Célula normal Alterações mitocondriais Vacuolização Inchaço
Perda da integridade de membrana Extravasamento de mediadores inflamatórios Desintegração de organelas

9 APOPTOSE Formação de Blebs Fragmentação internucleossomal do DNA
Diminuição do volume celular Condensação da cromatina Lise dos corpos apoptóticos Célula normal Formação dos corpos apoptóticos

10 Ações Importantes: Promoção da saúde; Detecção precoce;
Ações Importantes: Promoção da saúde; Detecção precoce; Assistência aos pacientes; Vigilância; Formação de recursos humanos; Comunicação e mobilização social; Na pesquisa e gestão do SUS; Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.

11 Terapias Anticâncer Cirurgia Radiação Ionizante Imunoterapia
Remoção da massa tumoral Cirurgia Radiação Ionizante Imunoterapia Terapia Dirigida Quimioterapia Mata rapidamente células tumorais em divisão, incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes Terapia que se utiliza do sistema imune para combater o câncer Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula tumoral Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias) KUMAR et al., 2004

12 Quimioterapia Definição: Objetivo primário:
Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007). Objetivo primário: Destruir células neoplásicas preservando células normais.

13 PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER
Microorganismos Organismos Marinhos Plantas Papaver somniferum Cryptotethya crypta Penicillium notatum Síntese Química A natureza é uma fonte rica em novas moléculas, com isso os produtos naturais (microorg...) são alvos extremamente explorados em busca de novas moléculas biologicamente ativas p tratamento de diversas doenças. No entanto vale ressaltar a importancia da sintese quimica, uma vez que podemos utilizar substancias obtidas inicialmente de prod naturais e produzi-las em larga escala. Além disso, a síntese química tb permite a remodelagem molecular visando produzir novos farmacos mais ativos, mais solúveis e com menos efeitos colaterais.

14 Drogas Anti-câncer Originadas de Plantas
Derivados da Vinca Vimblastina Vincristina Vindesina Taxanos Paclitaxel Docetaxel Camptotecinas Topotecano Irinotecano Podofilotoxinas Etoposídeo Tenoposídeo Vinca rosea Taxus brevifolia Camptotheca accuminata

15 Produtos Naturais x Derivados
Contudo há necessidade do desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversos do tratamento; O trabalho da química medicinal tem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótipos de drogas; (MARKMAN, 1998)

16 Produtos Naturais x Derivados
Número de drogas Derivados de prod. nat. Produtos naturais Nº de Drogas Aprovadas nos EUA até 2007 anos Adaptado de LI & VEDERAS, 2010

17 Problemática da Quimioterapia
Esquemas terapêuticos falhos; Altos índices de recidivas; Redução da sobrevida de pacientes; Efeitos adversos; Resistência Inerente Adquirida

18 Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae)
Utilizadas para tratamento: Hanseníase Cefaléia Dor de dente Doenças venéreas Dispepsia O Gênero Mitracarpus (Rubiaceae, tribo Spermacoceae), abrange aproximadamente 40 espécies representadas por plantas de porte herbáceo ou subarbustivo. Os principais centros de diversidade são o Brasil, o México e o Caribe. No Brasil são registradas 24 espécies, muitas das quais 2 com distribuição restrita. Algumas plantas do gênero Mitracarpus apresentam atividades antimicrobiana, antifúngica, antibacteriana, hepatoprotetora e citotóxica, sendo ainda empregadas no tratamento de várias doenças como: doenças venéreas. Constituintes químicos como flavonóides, saponinas, triterpenos, naftoquinonas e alcalóides têm sido registrados para o gênero. Nesta comunicação são apresentados os resultados obtidos com o estudo químico e farmacológico de Mitracarpus baturitensis Sucre.

19 OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42
Parte aérea seca (temp. Ambiente) Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH. Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida. Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica M. baturitensis foi coletado em maio de 2009, na Serra do Rosário, Sobral-CE. A parte aérea (518,2 g) foi seca à temperatura ambiente, triturada e submetida à extração exaustiva com hexano a frio, seguida de EtOH. As soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida, resultando nos extratos hexânico (6,9 g) e EtOH (37,8 g). A fração hexano/CH2Cl2 1:1 (713,3 mg), proveniente do fracionamento cromatográfico do extrato hexânico, após diversos procedimentos cromatográficos em gel de sílica, resultou no isolamento da benzoquinona benz[g]isoquinolina-5,10-diona (1; 12 mg) A determinação estrutural de 1 foi realizada 1 através da interpretação dos espectros de RMN He 13 C, bem como por análise comparativa dos dados 13 5 de RMN C registrados na literatura. O composto 1 foi submetido a ensaio citotóxico pelo método colorimétrico de microcultura MTT frente as linhagens tumorais humanas MDA-MB435 (mama), HCT-8 (cólon) e SF-295 (Glioblastoma), Tabela 1. Vale destacar que este composto já havia sido 53 testado contra outras linhagens de células neoplásicas benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)

20 Quinonas Definição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado. Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural; Amplo espectro de atividades biológicas: Microbicida Tripanossomicidas Viruscidas Antitumorais naftoquinona antraquinona benzoquinona

21 QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER

22 MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS
Inibição de Topoisomerase Geração de espécies reativas de oxigênio Neste esquema, sob ação enzimática, um substrato quinonoídico reduz-se com um elétron para formar o ânion semiquinona (Q•-), catalisada pelas enzimas flavinas NADPH citocromo P-450 redutase (E.C ), NADPH citocromo b5 redutase (E.C ) ou NADPH ubiquinona oxidoredutase (E.C ). A cinética desta redução depende de vários fatores, incluindo o potencial de redução da quinona. Uma vez formada a espécie semiquinona Q•-, esta reduz o oxigênio molecular ao ânion-radical superóxido (O - •) que, na pre- 2 sença da enzima superóxido dismutase (SOD, E.C. 2,55,56), é trans- formado em H O . Este ânion-radical superóxido (O -•), por catálise 222 com metais de transição (reação de Fenton72), ou por reação com H2O2 (reação de Harber-Weiss73), gera HO• no interior da célula. Embora o H2O2 não seja um radical livre, é uma substância bastante reativa, podendo promover também a oxidação de algumas biomo- léculas (Esquema 1). Em resumo, HO• e H2O2 são as principais espé- cies responsáveis pelo estresse oxidativo celular.

23 Objetivos Geral: Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de ação da FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.

24 Objetivos Epecíficos:
Determinar a IC50 da FR42 em um painel de linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue. Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence) Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.

25 METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO

26 Manutenção das Linhagens Celulares
Cultura de células Meio de cultura RPMI 1640; 10 ou 20% de soro fetal bovino; 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina); 3% de fitohemaglutinina (linfócitos). 10mL 37°C / 5% de CO2 Contagem/Observação Repique em meio de cultura novo

27 Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT
Contagem Células plaqueadas e drogas diluídas usando o HTS (High throughput screening) Cultura de células 0,039 a 5µg/mL 3 h MTT Absorbância em 595nm Formasan 72 h

28 + MTT Formazan NADH NADPH Redução Doadores de e- Succinato
Citoplasma meio extra-celular Berridge & Tan, 1993 Doadores de e- MTT NADH NADPH + Succinato

29 TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP
ENSAIO DO ALAMAR BLUE Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular. Forma oxidada Forma reduzida The assay plates are incubated at 37°C for 1–4 hours to allow viable cells to convert resazurin to the fluorescent resorufin product. The conversion of resazurin to fluorescent resorufin is proportional to the number of metabolically active, viable cells present in a population

30 Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h
Linhagens FR42 μM DOX Tumorais SF-295 2,0 (1,70 -2,45) 0,41 (0,34 – 046) 0,01-0,02 HCT-116 2,10 (1,72 – 2,48) 0,21 (0,15 – 0,29) OVCAR - 8 4,39 (3,53 – 5,40) 0,45 (0,29 – 0,52) HL-60 2,20 (1,90 – 2,77) 0,02 (0,02 – 0,03) Normais CMSPH 16,82 (12,18 – 23,27) 1,78 (0,52 – 1,80)

31 Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).
Revisar no material do

32 Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).

33 ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO

34 CITOMETRIA DE FLUXO

35 CITOMETRIA DE FLUXO 48 h Diluição com Corante desejado FR42
Células SF-295

36 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha. Viáveis Não Viáveis PRINCÍPIO DO TESTE: O IODETO DE PROPÍDIO É UM CORANTE NUCLEOFÍLICO FLUORESCENTE. SUA CAPACIDADE DE PENETRAÇÃO NA CÉLULA ESTÁ DIRETAMENTE RELACIONADO A RUPTURA DA MEMBRANA CELULAR (APOPTOSE TARDIA E NECROSE). NESTE CASO LIGA-SE AO DNA DE CÉLULAS NÃO-VIÁVEIS E EMITE FLUORESCÊNCIA. Iodeto de propídeo não ligado Iodeto de propídeo ligado

37 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

38 CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA
Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA. G1 G2/M DNA Fragmentado S Quantidade de DNA por núcleo Mitose Interfase G1 G2 S 4n 2n PRINCÍPIO DO TESTES: APÓS INCUBAÇÃO A CÉLULAS RECEBEM IP + AGENTE DETERGENTE PARA LISAR A MEMBRANA CELULAR E FAVORECER A LIGAÇÃO DO IP AO DNA E AVALIZAR A INTERFERÊNCIA DO COMPOSTO TESTE NA PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR.

39 FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA

40 CICLO CELULAR

41 POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA
Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência. Despolarizadas Polarizadas

42 POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

43 Microscopia Confocal SF-295 Tratar com os compostos testes 24h 24h
céls/poço Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de meio novo Adicionar 4 uL da Anexina V/AlexaFluor568 Resuspende com 200 uL de meio novo Lavar com PBS 15 min – temp. ambiente Hoechst – 10 min

44 Externalização da fosfatidilserina – Anexina V/Alexa Fluor 564
B Vermelho: Anexina V/AlexaFluor 568 Azul: Núcleo/Hoechst33342 C D A Cont. Negativo (DMSO) A anexina V é um marcador específico que se liga a fosfatidilserina. A fosfatidilserina é um fosfolipídeo de membrana. Que na célula viável fica na parte interna da membrana da célula. No processo apoptótico a maior parte da fosfatidilserina é é externalizada. Para verificar se esta fosfatidilserina B Doxorrubicina 0,3 uM C Droga 4 uM D Droga 8 uM Escala: 50 UM

45 CONCLUSÃO

46 OBRIGADO!


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