A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM."— Transcrição da apresentação:

1 INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA Fortaleza/CE 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA FACULDADE DE MEDICINA LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL

2 História Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos; Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010) Câncer (Grego - caranguejo) ◦ Hipócrates – Grécia Antiga Conjunto de doenças ◦ Crescimento desordenado ◦ Poder invasivo (BROWN & ATTARDI, 2005)

3 Câncer Fonte: OMS 2008 Em 2008: 7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo 70 % ocorreram em países de baixa ou média renda Até 2020: Cerca de 15 milhões de novos casos 60 % em países em desenvolvimento 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública Brasil – novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013)

4 Brasil Fonte: INCA 2011

5 Câncer “ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.” ATIVAÇÃO DE ONCOGENES SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR PROGRAMAS CELULARES: PROLIFERAÇÃO MIGRAÇÃO DIFERENCIAÇÃO APOPTOSE ALTERAÇÃO (HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)

6 Agentes Citotóxicos Dano ao DNA DNA reparado Mecanismos de morte funcionantes Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica Dano ao DNA – mutação Reparação de céls. com menor intensidade proliferativa Céls. transformadas Expanção clonal – câncer Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005 Carcinogênese

7 TIPOS DE MORTE CELULAR Catástrofe Mitótica Necrose LC 3 AutofagiaApoptose PS

8 NECROSE Célula normal Alterações mitocondriais Vacuolização Inchaço Perda da integridade de membrana Extravasamento de mediadores inflamatórios Desintegração de organelas

9 APOPTOSE Célula normal Diminuição do volume celular Condensação da cromatina Formação de Blebs Fragmentação internucleossomal do DNA Formação dos corpos apoptóticos Lise dos corpos apoptóticos

10 Ações Importantes: Promoção da saúde; Detecção precoce; Assistência aos pacientes; Vigilância; Formação de recursos humanos; Comunicação e mobilização social; Na pesquisa e gestão do SUS; Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.

11 Terapias Anticâncer Cirurgia Radiação Ionizante Imunoterapia Terapia Dirigida Quimioterapia Remoção da massa tumoral Mata rapidamente células tumorais em divisão, incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes Mata rapidamente células tumorais em divisão, incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes Terapia que se utiliza do sistema imune para combater o câncer Terapia que se utiliza do sistema imune para combater o câncer Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula tumoral Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias) Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias) KUMAR et al., 2004

12 Quimioterapia Definição: ◦ Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007). Objetivo primário: ◦ Destruir células neoplásicas preservando células normais.

13 Síntese Química Produtos Naturais MicroorganismosOrganismos Marinhos Plantas Papaver somniferum Cryptotethya crypta Penicillium notatum PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER

14 Drogas Anti-câncer Originadas de Plantas Derivados da Vinca Vimblastina Vincristina Vindesina Taxanos Paclitaxel Docetaxel Camptotecinas Topotecano Irinotecano Podofilotoxinas Etoposídeo Tenoposídeo Camptotheca accuminata Vinca rosea Taxus brevifolia

15 Produtos Naturais x Derivados Contudo há necessidade do desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversos do tratamento; O trabalho da química medicinal tem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótipos de drogas; (MARKMAN, 1998)

16 Produtos Naturais x Derivados Número de drogas Derivados de prod. nat. Produtos naturais Nº de Drogas Aprovadas nos EUA até 2007 anos Adaptado de LI & VEDERAS, 2010

17 Problemática da Quimioterapia Esquemas terapêuticos falhos; Altos índices de recidivas; Redução da sobrevida de pacientes; Efeitos adversos; Resistência ◦ Inerente ◦ Adquirida

18 Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae) Utilizadas para tratamento:  Hanseníase  Cefaléia  Dor de dente  Doenças venéreas  Dispepsia

19 OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42 benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42) Parte aérea seca (temp. Ambiente) Parte aérea seca (temp. Ambiente) Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de. Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH. Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida. Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida. Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica

20 Quinonas Definição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado.  Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural;  Amplo espectro de atividades biológicas:  Microbicida  Tripanossomicidas  Viruscidas  Antitumorais naftoquinona antraquinonabenzoquinona

21 QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER

22 MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS Inibição de Topoisomerase Geração de espécies reativas de oxigênio

23 Objetivos Geral: Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de ação da FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.

24 Objetivos Epecíficos:  Determinar a IC 50 da FR42 em um painel de linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue.  Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence)  Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.

25 METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO

26 Manutenção das Linhagens Celulares Cultura de células Meio de cultura RPMI 1640; 10 ou 20% de soro fetal bovino; 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina); 3% de fitohemaglutinina (linfócitos). 10mL 37°C / 5% de CO 2 Contagem/Observação Repique em meio de cultura novo

27 Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT Contagem 0,039 a 5µg/mL Cultura de células Células plaqueadas e drogas diluídas usando o HTS (High throughput screening) 72 h 3 h MTT Absorbância em 595nm Formasan

28 Formazan Redução Citoplasma meio extra-celular Berridge & Tan, 1993 Doadores de e - MTT NADH NADPH + Succinato

29 TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP ENSAIO DO ALAMAR BLUE Forma oxidadaForma reduzida Princípio: Baseia-se na redução do a lamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular.

30 LinhagensFR42 μMDOX Tumorais SF-295 2,0 (1,70 -2,45) 0,41 (0,34 – 046) 0,01-0,02 HCT-116 2,10 (1,72 – 2,48) 0,21 (0,15 – 0,29) OVCAR - 8 4,39 (3,53 – 5,40) 0,45 (0,29 – 0,52) HL-60 2,20 (1,90 – 2,77) 0,02 (0,02 – 0,03) Normais CMSPH 16,82 (12,18 – 23,27) 1,78 (0,52 – 1,80) Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h

31 Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).

32 C-

33 ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO

34 CITOMETRIA DE FLUXO

35 FR42 48 h Diluição com Corante desejado Células SF-295

36 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha. Viáveis Não Viáveis Iodeto de propídeo não ligado Iodeto de propídeo ligado

37 CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

38 CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA. G1 G2/M DNA Fragmentado S Quantidade de DNA por núcleo Mitose Interfase G1G1 G2G2 S 4n 2n

39 FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA

40 CICLO CELULAR

41 Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência. Despolarizadas Polarizadas POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

42

43 Microscopia Confocal SF céls/poço 24h Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de meio novo Tratar com os compostos testes 24h Adicionar 4 uL da Anexina V/AlexaFluor min – temp. ambiente Lavar com PBS Resuspende com 200 uL de meio novo Hoechst – 10 min

44

45 CONCLUSÃO

46 OBRIGADO!


Carregar ppt "INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google