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Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica

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Apresentação em tema: "Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica"— Transcrição da apresentação:

1 Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica
Inneke Marie van der Heijden Laboratório de Bacteriologia (LIM-54) Instituto de Medicina Tropical II Hospital das Clínicas - FMUSP

2 Características gerais
sair Grupo heterogêneo Unicelulares Diversidade Cor das colônias Textura Reprodução

3 Reprodução das leveduras
sair Assexuada Estado anamorfo Por brotamento ou gemulação Formação blastoconídios e pseudo-hifas

4 Reprodução das leveduras
sair Reprodução sexuada: conjugação Ascosporadas Candida guilliermondii (anamorfo) Pichia guilliermondii (teleomorfo) Anascosporadas Candida famata (anamorfo) Debaryomyces hansenii (teleomorfo) Balistosporadas Rhodotorula rubra Basidiosporadas Cryptococcus neoformans (anamorfo) Filobasidiella neoformans (teleomorfo)

5 Procedimentos laboratoriais
sair Diagnóstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ? Cultura: isolamento e identificação Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo

6 Meios mais utilizados na micologia
sair Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos filamentosos) Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos) Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à cicloheximida, inclusive leveduras)

7 Exame direto da amostra
sair “a fresco” entre lâmina e lamínula após clarificação com KOH (10 a 20%) com tinta da China (nanquim) após coloração: .esfregaços (Gram, Giemsa e outras) .cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)

8 Exame da cultura: achados microscópicos
sair Leveduras com filamentação (hifas) abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outras dezenas de gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp) Leveduras sem filamentação Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros capsuladas: Cryptococcus neoformans

9 Identificação Laboratorial
sair Exame direto - Leveduras

10 Coloração de GRAM sair

11 Coloração de Mucicarmin sair
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

12 Coloração de Gomori-Grocott sair
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

13 Identificação Laboratorial
sair Pureza das colônias Detecção por exame direto Sub-cultivo Técnica de esgotamento Meios seletivos Cloranfenicol: inibir bactérias Cicloheximida: inibir fungos anemófilos

14 Identificação Laboratorial
sair Características macroscópicas

15 Identificação Laboratorial
sair Características microscópicas

16 Técnica de esgotamento
sair Finalidade: obter colônias isoladas

17 Pureza das colônias sair Alternativa: meios cromogênicos
CHROMagar Candida Sugere espécie conforme cor da colônia: Verde = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espécies e outros gêneros

18 Identificação Laboratorial
sair Métodos clássicos Análise morfológica Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio Fermentação de carboidratos Hidrólise da uréia (teste da urease) Métodos comerciais

19 Métodos clássicos de identificação de leveduras
sair Análise morfológica presença de cápsula produção de tubo germinativo, em geral leitura às 2h cultivo em lâmina (micromorfologia, filamentação e presença de clamidosporos)

20 Tubo germinativo sair Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans Descrito em 1960 Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h) Humano, fetal bovino ou cavalo Técnica simples 94-97% de positividade para C. albicans Sidrim et al., 1999

21 sair Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7

22 1 - ausência de tubo germinativo 2 - presença de tubo germinativo
Análise morfológica sair Produção de tubo germinativo 1 2 1 - ausência de tubo germinativo 2 - presença de tubo germinativo

23 Produção de tubo germinativo
sair

24 Análise morfológica sair Cultivo em lâmina
Fonte: Manual da Anvisa, Módulo 7

25 Cultivo em lâmina sair Espécies de Candida spp

26 Candida albicans sair

27 sair

28 Análise morfológica sair Presença de cápsula

29 Análise morfológica sair Presença de cápsula

30 Métodos clássicos de identificação de leveduras
sair } Assimilação de fontes de C Assimilação de nitrogênio Fermentação de carboidratos ZIMOGRAMA Hidrólise da uréia (teste da urease) AUXANOGRAMA }

31 AUXANOGRAMA sair Presença de oxigênio Utilização de fontes de:
Carbono (a partir de açúcares) Nitrogênio (a partir de nitrato) CQ: cepas ATCC

32 AUXANOGRAMA sair Meio basal sem fonte de carbono Sólido ou líquido
Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL Inóculo: escala 1 McFarland (2mL) Incorporar suspensão de levedura ao meio Aplicação de discos ou açúcar in natura Incubação 30oC por 24-48h

33 sair

34 AUXANOGRAMA sair Meio basal sem fonte de nitrogênio
Sólido Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL Inóculo: escala 1 McFarland (1mL) Incorporar suspensão de levedura ao meio

35 Auxanograma sair Aplicação de compostos nitrogenados
Peptona (controle positivo) Nitrato de potássio Incubação 30oC por h até 7 dias Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)

36 sair

37 ZIMOGRAMA sair Baixa tensão de oxigênio Fermentação
Utilização de fontes de Carbono a partir de açúcares produção de CO2 Meio líquido ou semi-sólido gelosado a 0,6%

38 ZIMOGRAMA sair Meio basal (3mL)
Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura, peptona, etanol 95% e água Solução de açúcar 6% (1,5mL) Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo) Leitura após dias de incubação a 37oC Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de Durham

39 Testes adicionais sair Teste da urease Resistência à cicloheximida
Positiva: Cryptococcus neoformans Negativa: Candida albicans Resistência à cicloheximida Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea, C.guilliermondii e C.pseudotropicalis

40 Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica
Cultura positiva Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica sair Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + - Macromorfologia Tubo Germinativo Colônia bege: Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

41 Cultivo em lâmina sair

42 Provas bioquímicas sair Blastoconídios - Urease positiva:
Inositol - : Rhodotorula Inositol + : Cryptococcus Presença de artrósporos(=artroconidios) Urease - : Geotrichum Urease + : Trichosporon (brotamento +)

43 Artrósporos sair Geotrichum sp. www.botany.utoronto.ca

44 Artrósporos – Trichosporon sp.
sair

45 Trichosporon beigelii
sair

46 sair Sidrim et al., 1999

47 Métodos comerciais de identificação de leveduras
sair Chromoagar Candida API 20C AUX (BioMérieux) ID 32C (BioMérieux) Candifast (International Microbio) Vitek (BioMérieux)

48 Meios cromogênicos sair
Cromogênicos: detectam enzimas através de substratos específicos ou substratos cromógenos Permitem detecção de colônias mistas Rápida identificação de C. albicans

49 Chromoagar Candida sair Colônias: Verdes = C. albicans
Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espécies

50 Painel de identificação API20C AUX system (BioMérieux)
sair 19 testes assimilativos - incubação 30oC - 24, 48 e 72 horas Leitura por verificação de crescimento - turbidez Necessidade de correlação com a análise morfológica Informa a necessidade de testes adicionais Método de referência Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais

51 API20C AUX system (BioMérieux)
sair

52 API20C AUX system (BioMérieux)

53 API20C AUX system (BioMérieux)
sair

54 ID 32 C STRIPS (BioMérieux)
sair 29 testes leitura após 24/48 horas de incubação a 30oC - visual ou automatizada taxas de identificação variam de 94 a 98 % Ramani et al, 1998 taxa de identificação de 92% para as espécies comuns de leveduras 85 % para isolados raros apresenta uma base de dados bastante ampliada

55 Comparação entre os métodos comerciais semi-automatizados mais utilizados na identificação de leveduras sair Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.

56 Candifast (International Microbio)
sair Identificação e teste de sensibilidade Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces Único inóculo e leitura colorimétrica Resultados em 24 a 72 horas (37oC) Identificação sensibilidade actidione fermentação de 7 açúcares hidrólise da uréia Teste de Sensibilidade sete antifúngicos: 1 concentração Entre as cepas identificadas estão: Candida krusei; Candida glabrata; Candida tropicalis; Candida albicans e outras. No teste de sensibilidade encontram-se: Fluconazol; Miconazol; Cetoconazol; Econazol; Flucitosina; Nistatina e Anfotericina B.

57 Vitek system (BioMérieux)
sair Sistema automatizado: leitura turbidimétrica 26 substratos baseado nos métodos convencionais Bionúmero - banco de dados do sistema Resultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada

58 Vitek system (BioMérieux)
sair 16 espécies de Candida 6 espécies de Cryptococcus 3 espécies de Rhodotorula 2 espécies de Trichosporon 3 espécies de Geotrichum 2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca

59 Vitek system (BioMérieux)
sair Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais 93 % das leveduras comuns foram identificadas 55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas Falhas na identificação: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)

60 Vitek system (BioMérieux)
sair Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos comuns Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al, 1994)

61 Vitek 2 sair Vitek 2 ID YST Card
47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos) leitura fluorescente automatizada 15 horas de incubação base de dados com 51 espécies inclui Candida dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon taxa de identificação de 96,8%

62 Comparação entre métodos comerciais para identificação de leveduras
sair Candifast X Vitek 98% de concordância (www.int-microbio.com) Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001) 116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e outras leveduras) 87% de identificações corretas para API 20C 82,7% de identificações corretas para Candifast Diante disso a International Microbio desenvolveu o Candifast que se baseia: na susceptibilidade da cepa analisada à actidiona que se evidencia pela mudança de cor do indicador; na fermentação de sete açúcares; a determinação da resistência das leveduras a alguns agentes antifúngicos está baseada no crescimento ou na ausência de crescimento na presença de vários antifúngicos pela mudança de cor do meio pela fermentação da glicose ou hidrólise da uréia pelo indicador vermelho de fenol.

63 sair Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

64 sair Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

65 sair Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

66 Considerações finais sair Diversos métodos
Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em cada sistema Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais Escolha do(s) método(s) Realidade de cada laboratório Freqüência de isolamento Custo do teste Eficácia do teste


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