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Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica Inneke Marie van der Heijden Laboratório de Bacteriologia (LIM-54) Instituto de Medicina.

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1 Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica Inneke Marie van der Heijden Laboratório de Bacteriologia (LIM-54) Instituto de Medicina Tropical II Hospital das Clínicas - FMUSP

2 Características gerais Grupo heterogêneo Unicelulares Diversidade Cor das colônias Textura Reprodução

3 Reprodução das leveduras Assexuada Estado anamorfo Por brotamento ou gemulação Formação blastoconídios e pseudo-hifas

4 Reprodução das leveduras Reprodução sexuada: conjugação Ascosporadas Candida guilliermondii (anamorfo) Pichia guilliermondii (teleomorfo) Anascosporadas Candida famata (anamorfo) Debaryomyces hansenii (teleomorfo) Balistosporadas Rhodotorula rubra Basidiosporadas Cryptococcus neoformans (anamorfo) Filobasidiella neoformans (teleomorfo)

5 Procedimentos laboratoriais Diagnóstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ? Cultura: isolamento e identificação Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo

6 Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos filamentosos) Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos) Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à cicloheximida, inclusive leveduras) Meios mais utilizados na micologia

7 Exame direto da amostra “a fresco” entre lâmina e lamínula após clarificação com KOH (10 a 20%) com tinta da China (nanquim) após coloração:.esfregaços (Gram, Giemsa e outras).cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)

8 Exame da cultura: achados microscópicos Leveduras com filamentação (hifas) abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outras dezenas de gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp) Leveduras sem filamentação Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros capsuladas: Cryptococcus neoformans

9 Exame direto - Leveduras Identificação Laboratorial

10 Coloração de GRAM

11 Coloração de Mucicarmin Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

12 Coloração de Gomori-Grocott Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

13 Identificação Laboratorial Pureza das colônias Detecção por exame direto Sub-cultivo Técnica de esgotamento Meios seletivos Cloranfenicol: inibir bactérias Cicloheximida: inibir fungos anemófilos

14 Identificação Laboratorial Características macroscópicas

15 Identificação Laboratorial Características microscópicas

16 Técnica de esgotamento Finalidade: obter colônias isoladas

17 Pureza das colônias CHROMagar Candida Sugere espécie conforme cor da colônia: Verde = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espécies e outros gêneros e outros gêneros Alternativa: meios cromogênicos Alternativa: meios cromogênicos

18 Identificação Laboratorial Métodos clássicos Análise morfológica Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio Fermentação de carboidratos Hidrólise da uréia (teste da urease) Métodos comerciais

19 Métodos clássicos de identificação de leveduras Análise morfológica presença de cápsula produção de tubo germinativo, em geral leitura às 2h cultivo em lâmina (micromorfologia, filamentação e presença de clamidosporos)

20 Tubo germinativo Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans Descrito em 1960 Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h) Humano, fetal bovino ou cavalo Técnica simples 94-97% de positividade para C. albicans Sidrim et al., 1999

21 Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7

22 Análise morfológica Produção de tubo germinativo 1 - ausência de tubo germinativo 2 - presença de tubo germinativo 1 2

23 Produção de tubo germinativo

24 Análise morfológica Cultivo em lâmina Fonte: Manual da Anvisa, Módulo 7

25 Cultivo em lâmina Espécies de Candida spp

26 Candida albicans

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28 Análise morfológica Presença de cápsula

29 Análise morfológica Presença de cápsula

30 Assimilação de fontes de C Assimilação de nitrogênio Fermentação de carboidratos ZIMOGRAMA Hidrólise da uréia (teste da urease) Métodos clássicos de identificação de leveduras AUXANOGRAMA } }

31 Presença de oxigênio Utilização de fontes de: Carbono (a partir de açúcares) Nitrogênio (a partir de nitrato) CQ: cepas ATCC AUXANOGRAMA

32 Meio basal sem fonte de carbono Sólido ou líquido Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL Inóculo: escala 1 McFarland (2mL) Incorporar suspensão de levedura ao meio Aplicação de discos ou açúcar in natura Incubação 30 o C por 24-48h AUXANOGRAMA

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34 Meio basal sem fonte de nitrogênio Sólido Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL Inóculo: escala 1 McFarland (1mL) Incorporar suspensão de levedura ao meio AUXANOGRAMA

35 Auxanograma Aplicação de compostos nitrogenados Peptona (controle positivo) Nitrato de potássio Incubação 30 o C por h até 7 dias Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)

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37 Baixa tensão de oxigênio Fermentação Utilização de fontes de Carbono a partir de açúcares produção de CO 2 Meio líquido ou semi-sólido gelosado a 0,6% ZIMOGRAMA

38 Meio basal (3mL) Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura, peptona, etanol 95% e água Solução de açúcar 6% (1,5mL) Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo) Leitura após dias de incubação a 37 o C Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de DurhamZIMOGRAMA

39 Testes adicionais Teste da urease Positiva: Cryptococcus neoformans Negativa: Candida albicans Resistência à cicloheximida Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea, C.guilliermondii e C.pseudotropicalis

40 Cultura positiva Exame direto BactériaLevedura Cultura Pura SimNão Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + Macromorfologia Colônia bege: Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - Tubo Germinativo -+ C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua) Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica

41 Cultivo em lâmina

42 Provas bioquímicas Blastoconídios - Urease positiva: Inositol - : Rhodotorula Inositol + : Cryptococcus Presença de artrósporos(=artroconidios) Urease - : Geotrichum Urease + : Trichosporon (brotamento +)

43 Artrósporos Geotrichum sp.

44 Artrósporos – Trichosporon sp.

45 Trichosporon beigelii

46 Sidrim et al., 1999

47 Métodos comerciais de identificação de leveduras Chromoagar Candida API 20C AUX (BioMérieux) ID 32C (BioMérieux) Candifast (International Microbio) Vitek (BioMérieux)

48 Meios cromogênicos Cromogênicos: detectam enzimas através de substratos específicos ou substratos cromógenos Permitem detecção de colônias mistas Rápida identificação de C. albicans

49 Colônias: Verdes = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espécies Chromoagar Candida

50 Painel de identificação API20C AUX system (BioMérieux) 19 testes assimilativos - incubação 30 o C - 24, 48 e 72 horas Leitura por verificação de crescimento - turbidez Necessidade de correlação com a análise morfológica Informa a necessidade de testes adicionais Método de referência Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais

51 API20C AUX system (BioMérieux)

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54 ID 32 C STRIPS (BioMérieux) 29 testes leitura após 24/48 horas de incubação a 30 o C - visual ou automatizada taxas de identificação variam de 94 a 98 % Ramani et al, 1998 taxa de identificação de 92% para as espécies comuns de leveduras 85 % para isolados raros apresenta uma base de dados bastante ampliada

55 Comparação entre os métodos comerciais semi-automatizados mais utilizados na identificação de leveduras Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.

56 Candifast (International Microbio) Identificação e teste de sensibilidade Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces Único inóculo e leitura colorimétrica Resultados em 24 a 72 horas (37 o C) Identificação sensibilidade actidione fermentação de 7 açúcares hidrólise da uréia Teste de Sensibilidade sete antifúngicos: 1 concentração

57 Vitek system (BioMérieux) Sistema automatizado: leitura turbidimétrica 26 substratos baseado nos métodos convencionais Bionúmero - banco de dados do sistema Resultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada

58 16 espécies de Candida 6 espécies de Cryptococcus 3 espécies de Rhodotorula 2 espécies de Trichosporon 3 espécies de Geotrichum 2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca Vitek system (BioMérieux)

59 Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais 93 % das leveduras comuns foram identificadas 55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas Falhas na identificação: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)

60 Vitek system (BioMérieux) Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos comuns Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al, 1994)

61 Vitek 2 Vitek 2 ID YST Card 47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos) leitura fluorescente automatizada 15 horas de incubação base de dados com 51 espécies inclui Candida dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon taxa de identificação de 96,8%

62 Comparação entre métodos comerciais para identificação de leveduras Candifast X Vitek 98% de concordância (www.int-microbio.com) Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001) 116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e outras leveduras) 87% de identificações corretas para API 20C 82,7% de identificações corretas para Candifast

63 Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

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66 Considerações finais Diversos métodos Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em cada sistema Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais Escolha do(s) método(s) Realidade de cada laboratório Freqüência de isolamento Custo do teste Eficácia do teste


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