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Proteome analysis of X-ray irradiated human erythroleukemia cells Kelly Tinonº USP: 5413841 Letícia Oyamada nº USP: 5672034 Thays Nogueira nº USP: 5414157.

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1 Proteome analysis of X-ray irradiated human erythroleukemia cells Kelly Tinonº USP: Letícia Oyamada nº USP: Thays Nogueira nº USP: Eleuterio, E.; Di Giuseppe, F.; Sulpizio, M.; Di Giacomo, V.; Rapino, M.; Cataldi, A.; Di Ilio, C.; Angelucci, S. Biochimica et Biophysica Acta 1784 (2008)

2 Introdução Radioterapia  atingir o máximo de controle do tumor com o mínimo de complicações para os tecidos normais Radioterapia apresenta um efeito deletério em sistemas biológicos  tratamento de câncer Dose normal: frações de 2-3 Gy cada, durante 5 a 6 semanas Principal complicação da radioterapia  dano do tecido normal ROS interagem com DNA e proteínas  morte celular Efeitos radioresistentes Alteração da expressão de proteínas – reparo de DNA, apoptose, controle do ciclo celular, resposta a estresse oxidativo

3 Objetivo Identificação de proteínas envolvidas na resistência à radiação. Modelo: linhagem celular humana K562 de eritroleucemia radio- resistente Mecanismo de resistência: oncoproteína com atividade tirosina quinase (PTK) desregulada  envolvida na inibição da indução da apoptose e morte celular promovendo sobrevivência dessas células

4 Desenho do estudo Linhagem K562 submetida a 6 Gy de raio-X Dose subótima  protocolo de tratamento tumoral com radioterapia em humanos Análise de alterações no ciclo celular e microscopia 1 hora após tratamento  análise proteômica Identificação de proteínas relacionadas e sua expressão: Proteína stress-70 Glutationa transferase pi e ômega Complexo mitocondrial de síntese de ATP

5 Método Células K562 foram cultivadas em suspensão em meio RPMI 1640, suplementada com SFB, glutamina, HEPES, penicilina/estreptomicina em atmosfera controlada, a temperatura ambiente Irradiação com 6 Gy Cultura celular e tratamento com radiação ionizante

6 Método Após 24h após irradiação 2-5 x 10 5 células  centrifugação, (200g/10min/4ºC), fixação com etanol, ressuspensão, RNAse Ciclo celular  Citometria de Fluxo Avaliação da apoptose tardia  DNA subdiploide calculado e expresso em porcentagem de células apoptóticas versus não apoptóticas Detecção de células em apoptose precoce – Ensaio Annexin V - translocação de resíduo de fosfatidilserina para a parte externa da membrana plasmática Avaliação do ciclo celular e apoptose prematura

7 Resultados confluência de células na transição G2/M 4,6 % células apoptóticas

8 Resultados 14,2% apoptose precoce

9 Método Fixação, desidratação, adição de resina e polimerização com UV, corte ultrafino e fixação com acetato de uranila e citrato de chumbo  preservação da morfologia Fotografia com microscópio eletrônico Microscopia eletrônica

10 Resultados Não tratadaApoptose precoce: Condensação da cromatina e emarginação do núcleo (seta) Apoptose tardia: retração da membrana, separação de vesículas e cromatina densa

11 Método Suspensão de células foi centrifugada (1200 g), lavada com SFB gelado (3x) Extração das proteínas de 10 7 células com tampão de lise Sonicação do extrato (3 x/20 s), centrifugação, incubação com endonuclease, purificação Determinação da concentração de proteína  2D Quantin kit Preparação da amostra para Eletroforese Bidimensional (2DE)

12 Métodos Triplicata das amostras 1ª dimensão: separação das proteínas de acordo com seu pI em fita de 18cm, pH ª dimensão: separação das proteínas por massa molecular (gel com gradiente de 9-16% de poliacrilamida) Géis analíticos - nitrato de prata amoniacal Géis para espectrometria – prata sem glutaraldeído Eletroforese bidimensional Coloração

13 Método Proteínas marcadoras: proteína de choque térmico Hsp 90-alfa, Peroxiendoxina 1, Subunidade beta tipo 3 de Proteosoma (distribuídas nos géis e identificadas por espectrometria de massa) 3 géis para cada condição Parâmetros de comparação: % volume para quantificar os spots média (entre o menor limite de uma classe e o maior limite de outra classe) Análise das imagens

14 Resultados Não tratadas – 1430 ± 79 proteínas Irradiadas – 1590 ± 98 proteínas 83 % de proteínas coincidentes – coeficiente de correlação: 0,9

15 Método As proteínas das amostras controle e tratadas foram separadas em eletroforese uni e bidimensional e transferidas para membranas de nitrocelulose. Anticorpos primários diluídos 1:1000 Anticorpos secundários diluídos 1:3000 Medidas das bandas mono e bidimensionais Análise por Western-Blot

16 Resultados 5,46,2 EXPERIMENTOS MONO E BIDIMENSIONAIS – resultados semelhantes à análise do proteoma

17 Método Recorte dos spots do gel 2-DE Análise por mass finger printing (PMF) com MALDI-TOF- espectrômetro de massa Comparação com banco de dados Digestão de proteínas e MALDI-TOF- Espectrometria de Massa

18 Resultados 39 proteínas foram expressas diferentemente nas células não tratadas e nas tratadas 29 super-reguladas 10 sub-reguladas

19 Resultados 5,46,2 EXPRESSÃO CELULAR – análise do proteoma

20 Discussão Análise Annexin V  evidências de radioresistência Proliferação celular mais lenta (porcentagem de G2/M aumentada) Sensibilidade celular diminuída em situação de estresse Resposta apoptótica à radiação baixa (14,2 %) se comparada com outras linhagens celulares Análise proteômica Diferenças entre as proteínas expressas nos grupos estudados Associação dessas proteínas com atividades celulares importantes Metabolismo energético, motilidade do citoesqueleto, biossíntese proteica, detoxicação, entre outros. Super expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de carboidratos

21 Discussão PROTEÍNAEXPRESSÃOATIVIDADEOBSERVAÇÃO 3 isoformas dos fatores de elongação (EF1A1) AUMENTADACrescimento celular/ inibição da apoptose/ tumorigênese/ regulação do citoesqueleto Relato de resistência à cisplatina de células de câncer de cabeça e pescoço Proteínas de choque- térmico (Hsp) – Stress-70 e proteínas 1 do complexo T AUMENTADAAtuam como chaperonas para reconhecimento de proteínas com conformação anormal / defesa celular em condições de estresse RESITÊNCIA / SOBREVIVÊNCIA / PROLIFERAÇÃO CELULAR Enzimas conjugadas da Fase II (Glutationa transferase P1-1 e O1-1) AUMENTADAResistência a fármacos quimioterápicos (etoposide, cisplatina, docetaxol, tamoxifeno) Aumentadas em células radioresistentes – fator indicativo de dificuldades no tratamento quimioterápico DJ-1AUMENTADAProteção celular contra ROS Proteção contra radioterapia

22 Discussão PROTEÍNAEXPRESSÃOATIVIDADEOBSERVAÇÃO Creatina Quinase BAUMENTADATransferência de fosfato entre o ATP e fosfógenos RADIORESISTÊNCIA 2 comp. do complexo mitocondrial ATP sintase DIMINUÍDASíntese ATPtambém encontrada em células resistentes de câncer de cólon - RADIORESISTÊNCIA Proteína Actin-like 3 / tropomiosina cadeia alfa 3 AUMENTADA / DIMINUÍDA Polimerização da actina / ligação aos filamentos de actina e estabilização do citoesqueleto Desorganização do citoesqueleto/aumento da plasticidade = RESISTÊNCIA RuvB like2AUMENTADAHelicase dependente de ATP – reparo da dupla fita de DNA após exposição à radiação Proteção da célula tumoral contra radiação (observada no estudo)

23 Conclusão Identificação de inúmeras proteínas com alteração da expressão após radiação Stress-70, Glutationa transferase e ATP sintase Também relacionadas à resistência a fármacos antitumorais Mecanismo de radio e farmacoresistência podem ser semelhantes Análise proteômica  ferramenta simples e útil para identificação de biomarcadores da resistência celular Novas investigações com as proteínas descritas Novas estratégias para o tratamento de câncer Tratamentos radio e quimioterápicos combinados na terapia de leucemia humana


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