Human-Human Hybridoma Autoantibodies with Both Anti-DNA and Rheumatoid Factor Activities Aluna: Paula Fernandes Carneiro Professor: Michel Gantus.

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1 Human-Human Hybridoma Autoantibodies with Both Anti-DNA and Rheumatoid Factor Activities Aluna: Paula Fernandes Carneiro Professor: Michel Gantus

2 Artrite reumatóide Artrite reumatóide (AR) - doença inflamatória crônica caracterizada por poliartrite simétrica, principalmente das mãos, associada à rigidez matinal e fadiga. Em alguns casos outros órgãos e sistemas, além das articulações, podem estar envolvidos, como os olhos (uveíte), pulmões (pneumonite), glândulas salivares e lacrimais (síndrome de Sjögren) e sistema nervoso periférico (neuropatias). Cerca de metade dos pacientes com AR apresentam incapacidade para o trabalho após dez anos de doença.

3 Nos casos de quadro clínico progressivo e inflamação persistente pode ocorrer morte prematura. Diagnóstico precosse – tratamento mais eficiente - impedir a incapacidade na maioria dos pacientes. 0,5% a 1% da população. AR - início - qualquer idade - maior incidência: mulheres entre 40 e 50 anos. 5 mulheres – 2 homens. Membrana que envolve a articulação (sinovial) - processo inflamatório intenso caracterizado por hipertrofia do tecido e transformação funcional das células componentes desta membrana, os sinoviócitos. membrana sinovial normal – 1 camada de tecido Inflamada – até 10 camadas (macrófagos e fibroblastos transformados)

4 Lúpus eritematoso sistêmico 2 formas: 1) não apresentar erupções cutâneas, porém compromete os órgãos internos e é a forma mais grave da doença. O processo inflamatório sistêmico é capaz de afetar articulações, pele, pleura, pericárdio, sistema nervoso central, rins, coração, pulmões e outros órgãos. lúpus eritematoso cutâneo crônico (discóide) - envolvimento cutâneo (geralmente na face) - erupção em forma de “asa de borboleta” e/ou pápulas eritematosas, escamosas, que formam lesões anulares na cabeça e/ou partes do corpo quando expostas ao sol.

5 lúpus – início - febre, perda de peso, fadiga, mal-estar. etiopatogenia do lúpus - conjugação de fatores genéticos e ambientais envolvidos em sua eclosão. fatores genéticos - hormônios sexuais e anormalidades imunológicas. fatores ambientais - drogas; luz ultravioleta (UV); infecções viróticas e bacterianas; estresse, fatores étnicos e sócio- econômicos - colaborar para desencadear ou exacerbar o início da doença. Lúpus - quadro clínico crônico - longa duração e sem cura efetiva - alternando entre períodos de atividade e remissão do quadro.

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7 Introdução Fator reumatóide (FR) - anti-imunoglobulinas IgG – reação com IgG autólogos e heterólogos. FR - 70% dos pacientes com artrite reumatóide (AR), 30% dos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e em pacientes com outras doenças do tecido conjuntivo. FR - pode ser encontrada em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como tuberculose, hanseníase, sífilis, endocardite subaguda, e salmonelose, e em outros condições associadas com hipergamaglobulinemia ou imunocomplexos circulantes.

8 A origem e a função dos anticorpos antiimmunoglobulinas (FR) - desconhecida. Estudos sobre FR monoclonais e policlonais isolado do soro têm mostrado que a FR pode reagir com uma variedade de outras substâncias que IgG, incluindo grupos de nitrofenil e desnaturar DNA (dDNA), nucleossomas, complexo nucleoproteíco DNA, as histonas, etc. A base do estes reação cruzada é difícil de explicar, uma vez que estes antígenos não parecem apresentar uma homologia estrutural significativa com IgG. Hibridoma de autoanticorpo Homem-humano, derivados de pacientes com AR e LES - isolar e analisar FR monoclonal individuais e determinar suas reatividade com outros antígenos. A natureza das reações cruzadas destes anticorpos hibridoma com diferentes antígenos pode fornecer informações importantes sobre as propriedades do sítio de ligação do antígeno e os mecanismos responsáveis pela produção e patogenia de tais anticorpos.

9 Métodos fusão Seleção de hibridomas produtores de auto-anticorpos para dDNA, nDNA e Fc RIA em fase sólida para a ligacao do anicorpo a dDNA e nDNA Competição de ligação do FR hibridoma para tubos revestidos por Fc HIgG, dDNA e BSA Preparação de imunoglobulinas Purificação de fragmentos de Fac e Fc de IgG humana RIA em fase sólida para IgG de FR Focalização isoelétrica de hibridomas de auto-anticorpos

10 Resultados A fusão de LSP de 4 pacientes com AR e 5 pacientes com LES com o linfoblasto GM 4672 - 262 clones de hibridomas. AR - 4 fusões - 167 clones 2 anti-DNA 1 FR 6 anti-DNA e RF. LES - 5 fusões com - 95 clones 3 anti-DNA 0 FR 5 anti-DNA e RF A freqüência de clones de produzir tanto anti-DNA e RF foi 6 / 167 (4%) para a AR e 5 / 95 (5%) para LES. Produção anticorpos de hibridomas anti-DNA e FR através de pacientes com LES e AR.

11 Ligação de anticorpos hibridoma para dDNA e nDNA RA 8 dDNA 2 nDNA SLE 8 dDNA 2 nDNA

12 RIA em fase sólida para anticorpos IgM e fragmentos Fc RA – 3 fracos SLE – 1 náo vincula Fc

13 Competição de ligação do hibridoma RFpara tubos de Fc- revestido por hIgG, dDNA e BSA Competição HIgG e dDNA, mas não pela BSA. A) HIgG foi melhor competidor que dDNA. B) dDNA foi melhor competidor que HIgG.

14 hibridoma que não reage com dDNA.

15 Focalização isoelétrica

16 Discussão hibridoma humano - anti-DNA e FR. Dos 262 hibridomas - pacientes com AR e LES - 17 hibridomas - dDNA e fragmento Fc de IgG humano. Ligação - dDNA e Fc – anticorpo monoclonal - focalização isoelétrica géis e imunoabsorção. A dupla reatividade dos auto-anticorpos - experimentos de competição. Estes ensaios de competição apoiam a visão de que uma auto-anticorpos pode ter reatividade dupla. Os resultados do presente trabalho fornecer suporte para sitios de ligação de antígenos para dDNA e HIgG que estão próximas e, eventualmente, se sobrepõem. A elucidação da base molecular da reação cruzada de anticorpos é essencial para a compreensão do potencial de reatividade antigênica desses anticorpos in vitro e in vivo. O uso de anticorpos hibridoma oferece o potencial para designar verdadeira reação cruzada desses anticorpos e, finalmente, definir o antígeno relevante nestas doenças auto-imunes.

17 Obrigada!