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Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Depto. de Imunologia - IOC Lab. de AIDS e Imunologia Molecular Seminário Brasil França 2006 Diversidade.

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2 Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Depto. de Imunologia - IOC Lab. de AIDS e Imunologia Molecular Seminário Brasil França 2006 Diversidade Genética e Genotipagem do HIV-1 aos Anti-Retrovirais José Carlos Couto-Fernandez Fortaleza,CE NOVEMBRO 2006

3 Histórico  Descrição dos primeiros casos de AIDS (Gottlieb 1981, CDC 1982)  Isolamento do HIV-1: L. Montagnier, França (Barré-Sinossi 1983)  Isolamento do HIV-2: Clavel, França  HIV  Acentuada variabilidade genômica e fenotípica (Alizon 1984, 1986; Wain-Hobson 1985; Asjo 1986)  Primeiro isolamento do HIV-1 no Brasil (Galvão-Castro 1987)  HIV  Acentuada variabilidade genômica e fenotípica (Couto-Fernandez 1992, 1994; Potts 1993; WHO 1992,1994)  Estudos sobre diversidade do HIV são de fundamental relevância em relação ao desenvolvimento de vacinas anti-HIV/AIDS e a susceptibilidade aos ARV.

4 ESTIMATIVA DE ADULTOS/CRIANÇAS VIVENDO COM HIV/AIDS Oeste Europeu Norte e Centro- Leste da África África Sub- Saariana 25,8 milhões Leste Europeu e Ásia Central 1,6 milhão Sul e Sudeste da Ásia 7,4 milhões Austrália e Nova Zelândia América do Norte 1,2 milhão Caribe América Latina 1,8 milhão Total: 40,3 milhões Leste Asiático e Pacífico Fonte: Dezembro 2005

5 SUMÁRIO DA EPIDEMIA DE HIV/AIDS NO BRASIL Número de casos de HIV/aidsTotal Homens Mulheres Crianças< 13anos Categoria de exposição (Adultos) Sexual Sanguínea Vertical Mortes poraids Total Ignorada * Casos notificados até junho/2005 Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde/ PN-DST e Aids-MS, Prevalência: 0,65%

6 Notificações de Casos de Infecção pelo HIV-1 em Municípios Brasileiros ( ) Fonte:PN-DST/AIDS-MS, 2003

7 ESTRUTURA ESQUEMÁTICA DO HIV-1 Fonte: Família RETROVIRIDAE RETROVIRIDAE Subfamília LENTiVIRINAE Gênero LENTIVIRUS LENTIVIRUS

8 ORGANIZAÇÃO ESQUEMÁTICA DO GENOMA DO HIV-1 Adaptado de:

9 Length: feet Weight: 46,329 tons Length:.4 inches Weight: < 1 ug Comparison of Genomes: Human and Viruses Comparação dos genomas: humano e víral HIV-1 has to do many things with a limited genetic repertoire. Therefore, it exploits host factors in order to replicate. O HIV-1 tem muitas coisas para fazer com um repertório genético limitado, por isso ele utiliza fatores do hospedeiro para se replicar.

10 HIV-1 Life Cycle Ciclo de Vida do HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTION VIRUS MATURATION VIRION BINDING / UNCOATING NUCLEAR ASSOCIATION OF VIRAL cDNA

11 Protease inhibitors(PI) act to bind directly to the HIV protease and block its activity Os Inibidores de Protease(IP) agem ligando-se diretamente a protease do HIV bloqueando sua atividade

12 Erros de transcrição da transcriptase reversa (TR) viral TR não possui atividade de reparo de DNA > Transcrição Reversa = Mutação Genoma (RNA) de ~10 4 nucleotídeos Taxa de erro da TR = ~2,7 X mut / nt Índice de mutação de 1 erro/ pb Elevada taxa de replicação viral (> Vírus gerados por dia = a ) e de ciclos replicativos (> 300 ciclos/ano)  Substituições de nucleotídeos, deleções e inserções  Capacidade de recombinação  Pressao das drogas ARV seleciona virus mutantes ORIGEM DA DIVERSIDADE DO HIV-1

13 CLASSIFICAÇÃO DO HIV HIV-1HIV-1 - Pandemia Mundial -3 grupos: HIV-2HIV-2 - Oda África - Oeste da África -Homologia de 80% com SIV sooty mangabey -Homologia entre 40-60% com HIV subtipos: A, B e (C, D, E, F, G, H) Grupo M 9 Subtipos: A-D, F-H, J e K A-D, F-H, J e K - 32 CRF - 32 CRF - Várias URF - Várias URF Grupo O Guiné Equatorial, Camarões e Gabão Grupo N Camarões

14 Árvore filogenética dos diferentes grupos e subtipos de HIV-1

15 DISTRIBUIÇÃO GLOBAL DOS SUBTIPOS GENÉTICOS (env) DO HIV-1 C B E B C B B B A B A A D Other B A Other A B C Others 5% (F, G, H, J, NT) D 5.3% C C 47.2% E E 3.2% B B 12.3% A A 27% Adaptado de: Osmanov S, WHO-UNAIDS HIV Isolation and Characterization B C C C

16 RORAIMA (1) B,F,B/F B,F,B/F, C B, F,B/F B,F,B/F, C,D,A,CRF02_AG C,B, B/C,F,B/F,A DISTRIBUIÇÃO DOS SUBTIPOS DE HIV-1 NO BRASIL

17 DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO VIRAL DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO VIRAL VACINAS VACINAS SOROLOGIA RESISTÊNCIA aos ANTI-RETROVIRAIS PATOGENICIDADE IMPLICAÇÕES DA DIVERSIDADE DO HIV-1

18 Isolados de HIV-1 grupo O e HIV-2 são naturalmente resistentes aos ITRNN (Descamps, 1997). Redução de susceptibilidade in vitro aos ITR (ZDV, 3TC, ddI, NVP) de isolados de HIV-1 subtipo D (Palmer, 1997). Redução de susceptibilidade in vitro aos IP de isolados do subtipo G (Descamps, 1998). Redução de susceptibilidade in vitro aos ITRNN em isolados do subtipo F (Apetrei, 1998). Elevada ocorrência de mutações de resistência em amostras do subtipo C após dose única de nevirapina, em comparação aos subtipos A e D (Eshleman 2005) Diferentes estudos tem mostrado a existência de polimorfismos (‘minor mutation” e substituições atípicas) entre amostras não-B em posições associadas a resistência na protease e TR (Vergne 2000; Kantor & Katzenstein 2003). Subtipos de HIV e Susceptibilidade as Drogas Anti-retrovirais

19 Resposta ARV e Subtipos B/F JAIDS 24,4: , 2000

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21 Resistência in vivo ao Nelfinavir Primeira Falha ao Nelfinavir D30NL90M Resgate fácil Resistência cruzada (Não B = 100%) 57.1% 43.9%

22 Diversidade Genética do HIV e alteração natural da susceptibilidade a ARVs  Subtipo C e rápida resistência a ITRNN (V106M)  Subtipo F “resistência natural” aos IPs (L89M)  Subtipo C hipersusceptibilidade ao Lopinavir-r (I93L, CH50 = 0,35)

23 Programa Brasileiro para Terapia anti-HIV/AIDS Entre os diferentes programas conduzidos pelo Programa Nacional de DST e Aids-MS para pessoas vivendo com HIV/Aids, destaca-se o acesso universal gratuito as diferentes drogas que compoem a terapia anti- retroviral (TARV). Inicida nos anos 90 através da distribuição do AZT, este programa se consolidou ao longo dos anos. Em 1996 com a introdução da terapia combinada de alta potência (HAART), a grande maioria de dos indivíduos infectados pelo HIV-1, tem acesso garantido a todas medicações que compoem a TARV. Estabelecimento das redes de laboratorios para quantificacao de CD4/CD8 e carga viral do HIV-1. A politica brasileira de acesso universal a terapia anti-HIV tem resultado na queda dos níveis de morbidade e motalidade e uma melhora significativa da qualidade de vida dos indivíduos infectados (Marins e cols., 2003).

24 O desenvolvimento de resistência às drogas anti-HIV/Aids, além de acarretar a falha em suprimir a replicação viral, pode comprometer o Programa Brasileiro de acesso universal a TARV aos pacientes infectados. Com isto, o Ministério da Saúde através do Programa Nacional de DST e AIDS estabeleceu em 2002 a Rede Nacional de Genotipagem da Resistência do HIV-1 (RENAGENO).  Objetivo Principal Instalar uma rede composta de laboratórios e médicos de referência em genotipagem (MRGs), capacitados a realizar a interpretação dos exames de genotipagem para pacientes infectados pelo HIV/Aids através rede pública de saúde,. RELEVÂNCIA

25 Composto de 21 laboratórios nas 5 diferentes regiões do Brasil. Pará (PA): 01 Pernambuco (PE): 01 Bahia (BA): 01 Brasília (DF): 01 Minas Gerais (MG): 01 Rio de Janeiro (RJ): 03 São Paulo (SP): 03 Rio G. do Sul (RS): 01 ES, PR, SC,CE: 01 Rede de Laboratórios da RENAGENO

26 RENAGENO STRUCTURE Clinical Genotyping Reference Doctor-MRG Laboratory Analysis Collect samples

27 METODOLOGIA ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System V 2.0 (ABBOTT) Extraction / purification of viral RNA  Stage 1,3 mL plasma Sample Preparation Module HIV Plasmatic RNA Quantification agarose gel DNA Mass Ladder* RT-PCR Module, Prt/5’ RT cDNA PCR Module Amplified HIV-1 DNA Purificated DNA fragments * 1.8Kb

28 METODOLOGIA 2 Sequencing Module Sequencing Processing Sequences Analysis Sequence Analysis HIV-1 Resistance Report

29

30 Fisher’s exact test: *p< 0.05 * Prevalence of resistance-associated mutations in the protease gene Couto-Fernandez et al., 2005 * * * *

31 Prevalência de mutações de resistência aos inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa (INTR) Couto-Fernandez et al., 2006

32 Prevalência de mutações de resistência aos inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa (INTR) Couto-Fernandez et al., 2006

33 Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da protease (IP) Couto-Fernandez et al., 2006

34 Couto-Fernandez et al., 2005 Geographical distribution of the HIV-1 genetic subtypes in Rio de Janeiro State, Brazil.

35 Geographical distribution of the human immunodeficiency virus type 1 genetic subtypes in the state of Rio de Janeiro, Brazil Couto-Fernandez et al., 2006

36 ABSTRACT HIV-1 Subtype D occurs mainly in East and Central African countries, especially Uganda, where the prevalenceof HIV-1 infection is among the highest in the world. We present the phylogenetic analysis of one nonautochthonous and four autochthonous (including a near full-length genome) Brazilian HIV-1 subtype D strains identified in Rio de Janeiro State, where subtypes B, F1, and BF1 recombinants predominate. Phylogenetic inferences using maximum likelihood were applied on a near-full length genome and on concatenated gag, protease, reverse transcriptase, integrase, C2V3/env, gp41, and nef segments. Sequences from an Angolan immigrant showed close genetic similarity with a strain described in Finland, from an HIV patient of African origin, whereas all four autochthonous Brazilian sequences clustered with South African strains, where subtype D occurs only in isolated cases. Our results suggest the successful introduction and circulation in Brazil of closely related HIV-1 subtype D strains, possibly of South African origin.

37 FIG. 1. Maximum likelihood phylogenetic analysis places the near-full length 96BRRJ100 genome within the subtype D branch. Alignments were prepared with reference group M sequences gathered from the Los Alamos HIV database. Resultados 1

38 Resultados 2

39 Short Communication Accepted to AIDS Research and Human Retroviruses 2006 Molecular Epidemiology of HIV Type 1 in Inner Rio de Janeiro State, Brazil Walter A. Eyer-Silva, José Carlos Couto-Fernandez and Mariza G. Morgado ABSTRACT In the State of Rio de Janeiro, Brazil, HIV-1 diversity surveys have been performed mainly in the capital, and little is known about its molecular epidemiology in inner cities of the State. We studied a total of 87 polymerase sequences recovered from 2 different cohorts in 30 inner cities throughout the Rio de Janeiro State. Subtypes B (83.9%), F1 (8%), D (2.3%), and unique BF1 recombinants (5.7%) were demonstrated. The cross-sectional study found evidence that 41.6% of the patients harbored genetically related clusters of strains and probably took part in the same chain of viral spread. These clusters were phylogenetically unrelated to previously reported clusters from a neighboring city, suggesting that each small city harbors its own set of micro-epidemic lineages.

40 Prevalence of mutations known to confer reduced susceptibility to antiretroviral agents among 50 treatment-naïve and 45 antiretroviral-experienced HIV-1-infected patients receiving care in small cities of inner Rio de Janeiro State, Brazil, No.Presence of mutations known to confer reduced susceptibilityTotal RT onlyPR onlyRT + PR Treatment-experienced patients (n=45) Patients on HAART as of sampling388 (21%)1 (2.6%)2 (5.2%)11 (28.9%) Patients off-treatment as of sampling71 (14%)-- Treatment-naïve subjects507 (14%)-- Total95

41 ABSTRACT The reconstruction of the epidemic history of several HIV populations, by using methods that infer the population history from sampled gene sequence data, has revealed important subtype-specific and regional-specific differences in patterns of epidemic growth. Here, we employ Bayesian coalescent-based methods to compare the population history of the HIV-1 subtype B and F1 epidemics in Brazil from non-contemporary env and pol gene sequences. Our results suggest that after the introduction of the subtypes B and F1 into Brazilian population, around mid to late 1960s and late 1970s, respectively; these subtypes experienced an initial period of exponential growth with similar epidemic growth rates (~ year-1). Later, the spreading rate of both subtypes seems to have slowed-down since mid to late 1980s. This demographic pattern is very similar to that reported for the subtype B epidemics in high income countries where HIV was initially transmitted through homosexual intercourse and injecting drug use, as in Brazil; suggesting that the characteristics of transmission networks may be a key determinant of the HIV epidemic growth pattern. It is important to note that most of the subtype B and F1 sequences used in this study come from the Southeast region that has been the most affected by the AIDS epidemic in Brazil, being responsible for around 63 % of all AIDS cases reported since the early eighties; but may not represent the demographic trend of the HIV-1 epidemic in otherBrazilian regions. Infection, Genetics and Evolution, in press 2006

42 RESULTS

43 Fig 1. Bayesian phylogenetic trees of Brazilian C2-C3 env sequences. (a) Subtype F1sequences. Indexes: Brazilian sequences (.), sequences of African origin (.), and Romanian sequences (.). Subtype F2 reference sequences were used to root the tree, and the Most Recent Common Ancestor (MRCA) node of the Brazilian subtype F1 cluster is highlighted. (b) Brazilian subtype B sequences. Indexes: Brazilian “GPG” sequences (.),Brazilian “GWG”, “GCG”, “GLG”, “GRG”, and “GGG” sequences (.), non-Brazilian subtype B sequencesscale is in calendar years.

44 Fig 2. Bayesian skyline plots representing nonparametric estimates of effective number of infections through time for HIV-1 subtypes B (a) and F1 (b) epidemics in Brazil,

45 Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da transcriptase reversa

46 Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da protease

47 According to our findings, subtype F1 appears to have been introduced into Brazil between 10 and 15 years later (late 1970s) than the subtype B (mid to late 1960s), consistent with our previous report (Bello et al, 2006). This clearly suggests that subtype B HIV-1 epidemics in US, Western Europe, and Brazil started around the same time, which is fully consistent with the concurrent detection of the first Aids cases in those regions during early 1980s. These analyses also suggest that the Br-B variant emerged since the beginning of subtype B epidemic in Brazil, which explains the high prevalence of this variant in the country. The high growth rates described for the Brazilian subtypes B and F1 epidemics in the present work are consistent with such hypothesis, since in Brazil a significant proportion of the HIV-1 infections (~60%) can be attributed to homo/bisexuals and injecting drug users networks, in particular during the first years of the epidemic ( ) (Brazilian Ministry of Health., December 2005). No significant correlation was observed in the drug resistance evolution between subtype B and F strains. CONCLUSIONS

48 Submited to AIDS Research and Human Retroviruses 2006 SEARCHING FOR A CRF_B/F IN HIV-1 RECOMBINANT B/F VIRUSES FROM RIO DE JANEIRO, BRAZIL M Guimarães, Couto-Fernandez JC, Walter Eyer-Silva,C Siva-de-Jesus, S Teixeira, S Chequer-Fernandez,,M Morgado Lab. de AIDS & Imunol. Mol., Dep. de Imunologia, IOC; Rio de Janeiro, RJ, , Fundação Oswaldo Cruz Background: Brazil has been referred to be the one of “geographic recombination hotspots”, with a high frequency of mosaic viruses and up to now, at least three CRFs(12,28,29) and several URFs evolving subtypes B and F have been described. The present study is to search for common genetic recombinant profile among BF HIV-1 samples from Rio de Janeiro and compare them with those CRF B/F. Results: From these 1500 samples already analyzed just 47 could be characterized as BF in the pol gene, most of them presenting different patterns of recombination, but we were also able to identify 4 distinct well defined phylogenetic clusters, composed at least by 3 samples that share the same pattern of recombination. Conclusions: None of the four distinct B/F recombinant genetic profiles analyzed, gathered with high bootstrap value with CRF12,28 or 29, although some of them present some equal breakpoint.

49 BF1 recombinants (this study) Other Brazilian BF1 strains Subsubtype F1 Subtype B CRF_12 83 Subsubtype F1 CRF_ Subtype B REN REN & REN REN REN REN & 99UFRJ2BF REN & REN REN & BREPM108 REN & REN REN REN REN REN & REN REN Phylogenetic analyzes of BF recombinant forms

50 CRF_12 CRF_28 CRF_29 SUBTYPE B GROUP 3 GROUP 4 GROUP 5 GROUP 6 GROUP 7 GROUP1 BF GROUP 2 Sub-Subtype F1 BF BF B FB BFB BF BF Samples were analyzed using the SplitsTree Decomposition methodology. Subtype B and F as well as CRF 12, 28 and 29 references were use d in this evaluation. Bootscanning representation of samples characterized as recombinant in the different regions were represented here. Analysis of pol- PR/RT (1280bp) Phylogenetic analyzes of BF recombinant forms

51 CONCLUSÕES FINAIS 1 Uma grande proporção do subtipo B do HIV-1 foi observada em pacientes do Estado Rio de Janeiro, apresentando falha a terapia anti- antiretroviral. A baixa prevalência do subtipo F neste grupo, quando comparada a estudos prévios baseados no envelope viral, pode ser devido a elevada frequência de vírus recombinantes entre amostras do subtipo F. Observamos a circulação dos subtipos C e D do HIV-1, URFs CF e AF, além da primeira descrição no Brasil da presença das CRF02_AG e CFR01_AE no Estado do Rio de Janeiro. A distribuição das diferentes mutações de resistência no grupo de estudo mostrou correlação com a TAR utilizada.

52 A manutenção e implementação dos Programas de Genotipagem da Resistência do HIV-1 no Brasil, são de fundamental importância para a condução e reestruturação da TARV em pacientes apresentando falha virológica. A análise das sequências genômicas geradas pelo teste de genotipagem, pode servir para estudos de epidemiologia molecular de mapeamento da circulação de subtipos de HIV, bem como, para análises filogenéticas e evolutivas entre as diferentes amostras virais. CONCLUSÕES 2

53 COLABORADORES Mariangela B. Galvão Simão, Lilian I. Amaral, Orival S. Silveira, Denise FC. Souza e P. Chequer- PN DST&AIDS – Ministério da Saúde (www.aids.gov.br/renageno). Marcia Rachid - Programa Estadual de DST e AIDS - SESRJ Programas Municipais de DST e AIDS - SMSRJ Grupo de Médicos de Referência em Genotipagem (MRGs) do Estado do Rio de Janeiro Francisco I. Bastos - Centro de Informacao Cientifica – CICT/Fiocruz Waldilea Veloso - Centro de Pesquisa Clinica Evandro Chagas – IPEC/Fiocruz Martine Peeters, Eric Delaporte - Lab. Retrovirus – IRD, Montpellier, FR SUPORTE PN DST e AIDS-MS


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