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CURSO NACIONAL DE ATUALIZACAO EM PNEUMOLOGIA 19 A 21 DE ABRIL DE 2007 SÃO PAULO - SP TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA AFRANIO LINEU KRITSKI Programa Acadêmico.

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1 CURSO NACIONAL DE ATUALIZACAO EM PNEUMOLOGIA 19 A 21 DE ABRIL DE 2007 SÃO PAULO - SP TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA AFRANIO LINEU KRITSKI Programa Acadêmico de Tuberculose Faculdade de Medicina da UFRJ

2 Controle da TB em nível mundial – ESTRATÉGIA DOTS NAO É SUFICIENTE Incidência da TB está AUMENTANDO em áreas de elevada taxa de HIV, MDR e nas metrópoles Necessário implementar pesquisa p/ aumentar –a efetividade do tratamento com uso de novos fármacos (Regime 6 para 2 meses) –a detecção precoce de TB ativa e latente (uso de novas técnicas diagnósticas e/ou de novas intervenções no Sistema de Saúde) –o conhecimento da patogenicidade/bacilo e desenvolver novas vacinas

3 Tendência da incidência de TB em nível mundial 1990–2004 WHO Report Global tuberculosis control. WHO/HTM/TB/ Incidence per 100,000 Year

4 Prevalência de Infecção pelo HIV entre casos de TB em nível mundial The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement.  WHO All rights reserved HIV prevalence in TB cases, years (%) or more No estimate

5 Taxas de TBMR entre os casos novos de TB 3 – 6 % No estimate > 6% < 3% The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement.  WHO All rights reserved TB – multirresistente primária

6 Tuberculose multirresistente  TB-MDR  Definição: cepas resistentes a rifampicina e a isoniazida.  Emergiram na década de nos EUA e Europa.  No inquérito de 1996 no Brasil  TB-MDR primária 1% excluiu os soropositivos e excluiu os soropositivos e população de risco. população de risco.  Estudo global entre (58 regiões)  > 3% dos casos novos. “hot spots”  Estônia (14,1%) China (10,8%) “hot spots”  Estônia (14,1%) China (10,8%) Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%) Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%) Iran(5%) Moçambique(3,5%) Iran(5%) Moçambique(3,5%) India(3,4%) India(3,4%)  Estudo global entre (77 países)  Europa Oriental e Ásia Central com 14% dos casos novos. com 14% dos casos novos. OMS, % dos casos são resistentes a pelo menos 3 fármacos

7 Tuberculose multirresistente  TB-MDR (continuação). O RISCO PARA TB-MDR - usuários de drogas intravenosas (OR 4,68) - usuários de drogas intravenosas (OR 4,68) - desabrigados (OR 2,55) - desabrigados (OR 2,55) -viver em clínica de repouso (OR 2,05) -viver em clínica de repouso (OR 2,05) - tuberculose anterior (OR2,03) - tuberculose anterior (OR2,03) - prisões (OR 2,02) - prisões (OR 2,02) - ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01) - ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01) - imunossupressão sem HIV (OR 1,96) - imunossupressão sem HIV (OR 1,96) - AIDS (OR 1,96) - AIDS (OR 1,96) - trabalhador na área de saúde (OR 1,77) - trabalhador na área de saúde (OR 1,77) OR: odds ratio (razão de chance) Estudo em 4 países da União Européia. Casal et al.,2005

8 Taxa de notificação de TB em grandes áreas Metropolitanas América Latina Área Metropolitana Taxa de incidência /100,000 TB/HIVTB-MDR PaísMetropiPaísMetropPaísMetrop Bnos. Aires2742,5Não há vigilância Sistemática ??70% Río de J. Cidade 45,2114,38%11.2%42,6% São Paulo45,259,78%19,5%17,1% Lima e Callao108,192,3Não há vigilância Sistemática ??85% Montevideo (1997) 18,8 26,3Não vigilância Sistemática ND OPAS

9 Técnicas moleculares e suas contribuições no controle da TB no controle da TB 1.Filogenia (SNPs, RDs, etc) 2.Determinar distribuição geográfica de cepas (Spoligotyping, etc). 3.Estudo da dinâmica de transmissão (RFLP, MIRU?) (Investigação de surtos, desvendar cadeia de transmissão, conhecer a transmissão populações específicas, identificar fatores e grupos de risco) 4.Diferenciar reinfecção exógena de reativação/infecção policlonal (RFLP, DR-PCR) 5.Detectar contaminação laboratorial (RFLP, DR-PCR) 6.Detectar precocemente a TB por técnicas Amplificação Ácidos Nucléicos (i.e.: PCR) 7.Monitorar transmissão de cepas multirresistentes (Innolipa, GenotypeMTBDR)

10 Elementos/Eventos genéticos identificados em M.tuberculosis - bases das ferramentas moleculares.  Seqüências repetitivas DRs - Spoligotyping  “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs  Regiões de Deleção (RDs)  Seqüências de inserção - RFLP-IS6110  Elementos repetitivos de regiões intergênicas-MIRU-VNTR

11 A importância de estudos populacionais de genotipagem e caracterização integral dos genomas.  “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs  “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs polimorfismo de base única no gene katG códon 463 polimorfismo de base única no gene katG códon 463 (Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene gyrA (Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene gyrA  três grupos genéticos principais (PGG) três grupos genéticos principais (PGG)  Grupo 1 katG códon 463 CTG (Leu) e gyrA códon 95 ACC (Thr)  Ancestrais  Ancestrais  Grupo 2 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA códon 95 ACC (Thr) )  LAM  LAM  Grupo 3 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA códon 95 AGC (Thr) ) Sreevatsan et al,1997

12 Visão evolucionária proposta por Sreevatsan, 1997.

13 A contribuição da conhecimento das deleções no genoma de M.tuberculosis  Seqüênciamento de M.tuberculosis e M.bovis - comparação genômica  Identificação de regiões de deleção/inserção Ex:  10 regiões deletadas (RD1-RD10) em M.bovis- Pasteur estão presentes na cepa H37Rv Pasteur estão presentes na cepa H37Rv  dentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) em  dentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) em M.bovis verificou-se que RD1-RD3 são M.bovis verificou-se que RD1-RD3 são específicas específicas  as regiões RD9 são exclusivas de M.africanum  as regiões RD9 são exclusivas de M.africanum

14 Esquema evolucionário proposto por Brosh et al, 2002 Grupo 1 Grupo 2 Grupo3  Estirpes modernas modernas M.tb evoluiu em paralelo ao M.bovis

15 ESTUDOS DA DINÃMICA DA TRANSMISSÃO DE TB Método padrão ouro de genotipagem RFLP – IS6110 (cepas cluster)

16 “Mycobacterial Interspead Repetitive Units” MIRU-VNTR:  Amplificação por PCR de elementos repetitivos dispersos em regiões intergênicas. em regiões intergênicas.  Repetições possuem 40 a 100pb e variam em número de repetições e comprimento(VNTRs). repetições e comprimento(VNTRs).  12 loci e 15 loci.  Manualmente seguida por gel de eletroforese ou automatizado. Técnica mais fácil de realizar que o RFLP. Mas ainda não é considerada padrão ouro para análise de cluster no contexto clínico-epidemiológico

17 O método de genotipagem pelo MIRU-VNTR: Posição dos 41 MIRU-VNTR no cromossomo do M. tuberculosis H37Rv. O primeiro número indica a posição de cada lócus ocupado por um MIRU-VNTR. A letra c indica orientação contraria a estabelecida por Cole et al, em Algarismos romanos indicam o tipo de MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de cada loci. A esfera em preto indica os 12 loci com número variável de MIRU-VNTR.

18 Reinfecção exógena de pacientes HIV. Tipagem por DRE-PCR e RFLP Lourenço et al no Brasil e Warren R, 2005 na Africa do Sul Uso de técnicas moleculares para confirmar reinfecção com nova cepa Mtb, mesmo em países em desenvolvimento

19 Países desenvolvidos – Década de 1990 Fatores de risco para agrupamento genotípico (“cluster”) – INFECÇÃO RECENTE Atendimento anterior em Hospital sem biossegurança Institucionalização prévia (prisão) HIV e estágio Idade Drogadição Resistência Doença cavitária Small et al, 1994; Tabet et al., 1994; Shafer et al., 1995; Ferrazoli et al., 2000 Diaz et al., 2001; Mc Conkey et al., 2002; Tudó et al., 2001; Barnes et al., 1997; F rench et al., 1998; Lockman et al., 2000

20 Estudos de epidemiologia molecular - Novo Milênio “Spoligotyping” Alguns genótipos de Mtb: se disseminam com maior rapidez são mais virulentas mais associadas com falências e recidivas RFLP Daley CL. Clin Chest Med 26 (2005) 217 – 231 Bjune G, Clin Exp Immunol Sep;145(3):389-97

21 Na América Latina, não há dados a respeito dos resultados do tratamento anti-TB; associaçao com fatores genotipicos das cepas M. tb; frequência de mutações dos genes de resistência Estudos que avaliaram distribuição de cepas W/Beijing Foi descrito associação de surtos MDR em hospitais e prisões Relevância: Identificar marcadores geneticos associados a resistencia a drogas, doença, falência tratamento= desenvolvimento novos testes de identificação simples e rápidos

22 Kamerbeek et al, 1997 A.Estrutura das DR no  genoma das micobactérias genoma das micobactérias B. Amplificação das DR por PCR  C. Padrões de hibridização spoligo-tipos  spoligo-tipos  “Spoligotyping”

23  Baseado no locus “direct-repear” DR  cópia única com 10 a 50 repetições de DR com 36pb separadas por seqüências repetições de DR com 36pb separadas por seqüências espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa) espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa)  Principais famílias/sub-famílias do Complexo M. tuberculosis: East African and Indian”-5 sub-famílias East African and Indian”-5 sub-famílias Haarlem – 3 sub-famílias Haarlem – 3 sub-famílias Middle Eastern Asian -2 sub-famílias Middle Eastern Asian -2 sub-famílias ”T”, “S”, “X” ”T”, “S”, “X” Latin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famílias Latin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famílias Beijing (sub-tipo antigo e moderno) Beijing (sub-tipo antigo e moderno) “Spacer oligonucleotide typing” Spoligotyping

24 Distribuiçao de genótipo Beijing de tuberculose Blue: stable, no drug resistance; Red: increasing, associated with drug resistance; Green: increasing, drug sensitive; Yellow: absent; Striped: trend and/or drug resistance not known >29,000 pacientes de 35 países Mutator gene mut, ogt

25 Relação entre TB resistente e W- genótipo Beijing em Archangel- Russia Drobniewski F, JAMA 2005; 293 (22):

26 8 genotype strains (2001) 17 genotype strains (2002) Em camundongo infectado com cepa Beijing: maior mortalidade maior mortalidade maior n. de bacilos no pulmão maior n. de bacilos no pulmão menor produção de TNF  + IFN  menor produção de TNF  + IFN  menor proteção de vacinação menor proteção de vacinação com BCG com BCG Virulência de M. tuberculosis em camundongo BALB/c Rad M.E. EID 2003; 9: Lopez B. Clin Exp Immunol 2003; 133:30-7.

27 Cepas resistentes a Isoniazida mais virulentas Análise molecular - Holanda

28 Holanda, pacientes, 59% estrangeiros todos os isolados: TSA, IS6110 RFLP determinação de katG 315 de cepas INH resist 592 (7,1%) INH resistente 323 (54,6%) katG315 mutante 269 (45,4%) katG315 tipo selvagem Transmissibilidade de cepa de M. tuberculosis resistente Estudo populacional Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect (8):

29 Relação entre perfil katG 315 com a ocorrência de agrupamento (cluster) entre cepas Mtb resistentes a INH Cluster Sim Não Odds ratio (95% CI) INHr 315wild ( ) INHs Ref INHr 315mutant ( ) Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect (8):

30 The population structure of Mycobacterium tuberculosis in different geographic areas Beijing genotype LAM; Haarlem LAM; Beijing Haarlem

31 Projects using spoligotyping Phylogeny Spol DB3 (Institut Pasteur, Guadeloupe; Filliol et al. JCM 2003) (SpolDB4; Brudney et al. 2006) – strains (+/- 150 Brazilian) (39.000) –> 90 countries (140) –population genetics, biogeographic distribution and phylogeny of Mtb Complex –Rio: 400 patients >50% LAM 7% Haarlem 10% new LAM Only 2 Beijing Finetuning with MIRU-VNTR

32 MDR TB epidemic in Argentina: rise, decline, aftermaths Buenos Aires Rosario Population Country: 36,000,000 Buenos Aires: 11,000,000 Rosario: 1,100,000 AIDS association Hospital setting Explosive transmission Rapid progression to disease Fatal outcome MDR TB outbreaks arose in the early ´90s in two overpolutated cities

33 MDR TB outbreak Hospital Muñiz, Buenos Aires,

34 Profile of outbreak MDR TB strains StrainCity Number of cases in SubLineage katG MBuenos Aires15051Haarlem 2mut RaRosario1512LAM3mut RbRosario86T1 (Tuscany)wild CBuenos Aires151T5wild Análise molecular demonstra a epidemia por TB-MDR de cepas Mtb tipo Haarlem 2 na Argentina

35 Papel de outros genótipos de M.tuberculosis em países em desenvolvimento ? Genótipo Beijing infrequente na America Latina (<5%) Escassos dados sobre surtos de TB, resistência as drogas analisados com ferramentas moleculares Genótipo Haarlem também apresenta mutator gene e pode estar associado com maior virulência e/ou desenvolvimento de resistência

36 Sympatric - allopatric Interações diferentes diferentes do bacilo com do bacilo com hospedeiro hospedeiro Homem ?? Homem ??

37 Diagnóstico da Tuberculose

38 Nucleic Acid Amplification Trials

39 Métodos Diagnósticos Amplificação de Ácidos Nucleicos (AAN) Kits commerciais  E-MTD assay (Gen Probe Inc) aprovado pelo FDA: baar (-) (+)  AMPLICOR MTB kit (Roche )*  LC x Probe System (Abbot)*  Strand Displacement Amplification* * aprovados pelo FDA para escarro baar (+) LCx ® Mycobacterium tuberculosis Assay Cobas Amplicor ™ Mtb Test Validados APENAS para: 1. amostras respiratórias 2. pacientes adultos, 3. HIV soronegativos, 4. não tratados para TB

40 Métodos de detecção da resistência Métodos Genotípicos Métodos Fenotípicos DNA Heteroduplex Proporções (Canetti et al1963)  SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism) Automatizados Bactec 460-TB, MGIT 960  Line Probe Assay (INNO-Lipa Rif TB)** LRP - Luciferase Report Phage Teste Hain p/ INH e RIF **E-test Sequenciamento de DNAMIC (MABA,MTT, etc.) * Padrão ouro; ** Comercializados na Europa

41 Molecular MDR screening with line probe

42 GenoType ® MTBDRINNO-LiPA Rif.TB CompanyHain LifescienceInnogenetics M. tub detectionYesyes Detection of RMP Resistance of M. tub ComplexYesyes Detection Isoniazid Resistance of M. tub ComplexYesno Strip AssayYesyes DNA-Basis: PCRYesyes Culture requestedYesyes Direct assayNoyes (modified version M. tub-Komplex Detection: 23S-rRNA/16S-rRNAYesyes RMP-Resistance: rpoB geneYesyes INH-Resistance: katG geneYesno UniversalcontrolYesno rpoB unicontrolYesno kat G unicontrolyesno Comparison GenoType® MTBDR and INNO-LiPA Rif.TB

43 Prioridades para pesquisa e investimento em Tuberculose – 2006 OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de Harvard e da Zâmbia Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006  Melhorar o diagnóstico: otimizar os métodos existentes e implementar novos sob modelo de custo-efetividade  Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos  Remodelar estratégias de tratamento  Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e a vulnerabilidade  Capacitar unidades para ensaios clínicos Prioridades para pesquisa e investimento em Tuberculose – 2006 OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de Harvard e da Zâmbia Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006  Melhorar o diagnóstico: otimizar os métodos existentes e implementar novos sob modelo de custo-efetividade  Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos  Remodelar estratégias de tratamento  Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e a vulnerabilidade  Capacitar unidades para ensaios clínicos

44 Nosso paciente com TB nao conta com novas tecnologias, como outras pacientes com Hepatite B, C HIV Doenças Cardíacas Doenças Renais PORQUE??

45

46 Obrigado Cidade do Rio de Janeiro

47 OBRIGADO PELA ATENÇÃO


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