Vacinas de nova geração para Rotavirus

Apresentação em tema: "Vacinas de nova geração para Rotavirus"— Transcrição da apresentação:

1 Vacinas de nova geração para Rotavirus
Paula Alves Laboratório de Tecnologia de Células Animais Ciência em Portugal – Ciência 2007 A5 – Biologia, Biotecnologia, Bioquímica Lisboa, 13/Abril/2007

2 Vacinas para ROTAVIRUS (no mercado desde 2006)
Causa de ~ 40% das hospitalizações devidas a Gastroenterites agudas Aprox mortes/ano em 111 millhões de episódios de diarreia aguda em crianças com idades inferiores a 5 anos) VP2 VP4 VP6 VP7 VP3 VP1 98 nm Reoviridae Family Vacinas para ROTAVIRUS (no mercado desde 2006) RotaTeqTM (aprovada pela FDA) RotarixTM (aprovada pela EMEA) Virus atenuados em cultura VACINAS DE NOVA GERAÇÃO VLP (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus

3 VLP’s (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus
i. Eficazes - mimetizam particulas virais nativas (conformação e apresentação dos antigénios ao sistema imunitário) ii. Seguras (não contêm material genético – ADN e ARN) iii. Custos reduzidos (após optimização dos processos de produção) VLP’s já no mercado: Hepatite B (desde 1986) Virus do Papiloma Humano (HPV) : Gardasil® e Cervarix® Primeira vacina no mercado contra o cancro cervical VLP’s com UMA única proteína viral

4 Rotavirus-Like Particles
@ Lab TCA VLP para PPV (irá ser comercializada pela Ingenasa (Espanha) VLP candidata para HIV (utilizada em testes de diagnostico pela Innogenetics (Bélgica) VLP para ROTAVÍRUS Rotavirus-Like Particles

5 OBJECTIVO Desenvolvimento de Bioprocessos para produção de Rota VLPs
Monomeros das proteínas virais nas proporções e nos tempos ideais (Estequiometria e termodinâmica) Formação das VLP’s Estatistica da infecção Expressão das proteínas Desenvolvimento de Bioprocessos para produção de Rota VLPs “Re-desenhar” o genoma do Baculovirus (a nível dos promotores dos genes das proteinas recombinantes) “Re-desenhar” estratégias de infecção (MOI and TOI)

6 Partículas 2/6/7 VLP (triplas)
Particulas duplas 2/6 VLP Monomeros de VP7 Infecção com 3 Baculovirus Recombinantes (transportam genes que codificam as proteínas vp2, vp6 e vp7) Trimeros de VP6 Monomers of VP7 vp2 gene 1 vp6 gene 7 Partículas 2/6/7 VLP (triplas) vp7 gene 2 6 VP6 VP7 H+ H+ H+ H+ H+ H+ VP2 H+ H+ H+ H+ 4 H+ H+ 5 vDNA mRNA 3 Membrana Celular Membrana Nuclear

7 Técnicas analíticas Infecção Expressão dos genes Montagem VLPs
Caracterização das cinéticas de infecção dos baculovirus Tráfego viral na célula hospedeira Replicação do transADN (vp2, vp6 and vp7) Transcrição - mARN (vp2, vp6 and vp7) Produção das proteínas recombinantes (VP2, VP6 and VP7) Expressão dos genes Montagem VLPs Montagem em partículas formadas correctamente (três camadas) Estratégias de assembly/disasembly/reasembly Purificação VLPs Purificação Gradientes de CsCl (ultracentrif.) Filtração Gel Chromatografia Ultrafiltração Western blot, HPLC, Proteína total ELISA Espect. de massa Microscopia Q-PCR RT-Q-PCR Técnicas analíticas

8 MODELAÇÃO DA PRODUÇÃO DE VLP’s PARA ROTAVIRUS
1,6 9,0 1,4 6 7,5 Cinéticas de Infecção 10 1,2 10 6 - 1 ) 1,0 6,0 1 - ) do Baculovirus (Cell.ml 0,8 (Virus.ml 4,5 N i 0,6 j 3,0 0,4 V e tráfego viral 0,2 1,5 4,0 24 48 72 96 120 144 4 10 ) 3,5 Time (hpi) 1 - 3,0 Replicação ADN (CopiesDNA.cell 2,5 2,0 1,5 T 6 DNA 1,0 0,5 24 48 72 96 120 144 Time (hpi) 12 10 3 1 ) 10 - Expressão dos genes 8 Sintese do mARN (CopiesDNA.cell 6 4 7 RNA 2 24 48 72 96 120 144 Time (hpi) 1,6 1,4 10 3 ) 1,2 Produção de Proteinas Protein Production 1 - 1,0 (AU.ml 0,8 VP 7 0,6 0,4 0,2 700 600 24 48 72 96 120 144 Montagem dasVLPs 1 g.ml - ) 500 Time (hpi) m 400 VLP ( 300 200 100 bVP2+bVP6+bVP7 bVP2/6/7 Colaboração com grupo Rui Oliveira

9 Re-desenhar o genoma do Baculovirus
Formação das VLP’s Estatistica da infecção Expressão das proteínas Monomeros das proteínas virais nas proporções e nos tempos ideais (Estequiometria e termodinâmica) Desenvolvimento de Bioprocessos para produção de Rota VLPs Re-desenhar o genoma do Baculovirus “Re-desenhar” estratégias de infecção Antonis AF, Bruschke CJ, Rueda P, Maranga L, Casal JI, Vela C, Hilgers LA, Belt PB, Weerdmeester K, Carrondo MJ, Langeveld JP., A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure. Vaccine, 24(26): Vieira, HLA, Estevão, C, Roldão, A, Peixoto, C, Sousa, M, Cruz, PE, Carrondo MJT, Alves, PM (2005) “Triple layered rotavirus VLP assembly: kinetics of vector replication, mRNA stability and recombinant protein production”, Journal of Biotechnology, 120: 72-82 Vieira, HLA, Pereira, ACP, Carrondo, MJT, Alves, PM (2006) “Catalase effect on apoptosis for the improvement of recombinant protein production in baculovirus-insect cell system”, Bioprocess Biosystems Engineering., 29, Peixoto, C, Sousa, MFQ, Silva, AC, Carrondo, MJT, Alves, PM (2007) “Downstream Processing of Triple-layered Rotavirus Like Particles”, Journal of Biotechnology, 127, Roldão, A, Vieira HLA, Alves, PM, Oliveira, R, Carrondo, MJT (2007) Intracellular dynamics in Rotavirus-like particles production: Evaluation of multigene and monocistronic infection strategies. Process Biochemistry, 41, Roldão, A, Vieira, HLA, Charpilienne, A, Poncet, D, Roy, P, Carrondo, MJT, Alves, PM, Oliveira, R (2007) Modeling Rotavirus-Like Particles production: infection kinetics, baculovirus DNA replication, mRNA synthesis and protein production” J Biotechnology, 128(4):

10 Hopitaux de Paris (France)
FCT-UNL (Portugal) Rui Oliveira LSHTM (UK) Polly Roy CNRS (France) Jean Cohen Didier Poncet Annie Charpilienne Karolinska (Sweden) Lennart Svensson Hopitaux de Paris (France) Nathalie Parez RVC (UK) Janice Bridger CIC Vaccinologie C Pasteur (France) Odile Launay Lab TCA (ITQB/IBET) Equipa Rotavirus Paula Alves Manuel J. T. Carrondo Helena Vieira António Roldão Cristina C. Peixoto Claudia Istrate Marcos F.Q. Sousa Catarina Estêvão Rosário Clemente Candida Mellado Financiamento European Commission (QLRT ) FCT (FCT/POCTI/BIO/55975/2004) SFRH/BPD/14575/2003 SFRH/BD/21910/2005