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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre.

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1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico)

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O que é um Citometro de Fluxo?

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O que é um Citómetro de Fluxo? É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?) É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?) Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz. Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz.

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo Suspensão de partículasSuspensão de partículas Fluxo laminarFluxo laminar FluídosFluídos ÓpticaÓptica ElectrónicaElectrónica Conversão do sinal em valores analógico-digitaisConversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computadorAquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador Fonte de iluminaçãoFonte de iluminação Captação da dispersão da luz e da fluorescênciaCaptação da dispersão da luz e da fluorescência Filtração da dispersão e da fluorescênciaFiltração da dispersão e da fluorescência

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo: Metabolismos Receptores ADNCitoquinas Enzimas Antigénios celulares Tamanho Complexidade

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Propriedades de FSC e SSC Laser

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS ) Sensor de FS Laser

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS ) Laser Sensor de FS Sensor SS 90 0

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Óptica - Dispersão da Fluorescência Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.)

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Óptica - Propriedade dos Filtros Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 45 o Luz Reflectida Luz Transmitida Fonte de Luz

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda BD

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula? Tamanho (FSC) Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Complexidade (SSC) Fluorescência relativa. (FL1, FL2, FL3, FL4,...) Fluorescência relativa. (FL1, FL2, FL3, FL4,...)

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O que é a Fluorescência? Laser

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Intensidade de Fluorescência Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites FITC Intensidade de Fluorescência Numero de eventos

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission) FluorochromeLaser (nm)Emission (nm) FITC Cy R-PE (PE) PE-Texas Red (PE-TR) Pe-Cy5 (TC 1 ) PerCP (BD 2 ) PerCP/Cy5.5 (BD) PE-Cy Texas Red APC 633, Cy5 633, APC-Cy7633,

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Espectros de Emissão PerCP Wavelength (nm) RPEAPC FITCPI

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Pulso electrónico Laser Laser Laser Time Voltage Time Voltage Time Voltage

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Tipos de diagramas 1 parâmetro 1 parâmetro Histograma Histograma 2 parâmetros 2 parâmetros Dot Plot Dot Plot Contour plot Contour plot Density plot Density plot

22 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Dot plot Histograma As Regiões ou Portas electrónicas

23 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA Energía Fluorescencia Molécula Receptora Texas Red/Cy5/Cy7 Molécula Receptora Texas Red/Cy5/Cy7 Molécula Donadora PE Molécula Donadora PE GS ES Transferencia no radiativa de energía

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 3 COLORES

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 4 COLORES

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 5 COLORES

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cytomics FC500

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cytomics FC500 OPTICA: 2 lasers colineares: 2 lasers colineares: 488 nm 488 nm 633 nm 633 nm Detectores: Detectores: FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°) FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°) Side Scatter Side Scatter 5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm) 5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm)

29 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cytomics FC500 OPTICA: 488DLP 500LP 600DLP 550DLP 525BP 620DSP 620SP 710DLP 755LP 675BP FL1 FL2 FL5 FL4 FL3 Detailed Filter Specs Side Scatter

30 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda COMPENSATION

31 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Wavelength nm IntensityFITCFITC PE ECD PC5

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Intensity FITCFITC PE ECD PC5 FL1 525

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Intensity FITCFITC PE ECD PC5 FL1 525 FL2 575

34 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Intensity FITCFITC PE ECD PC5 FL1 525 FL2 575 FL3 620

35 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Intensity FITCFITC PE ECD PC5 FL1 525 FL2 575 FL3 620 FL4 675

36 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda 12 <0.1 1 Nominal Measured Signal FL1 FL2 FL3 FL4 FITCFITC

37 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda FITCFITC PE ECD PC5 FITC+FITC+ PE+ ECD+ PC5+ FL1 FL2 FL3 FL4

38 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda FL1 FL2 FL3 FL4 FITCFITC PE ECD PC5 ???????? ????

39 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda FL1 FL2 FL3 FL4 FITCFITC PE ECD PC5 85.5% 10.5% 3.1% 0.9% 0.7% 67.8% 25.0% 6.5% 0.3% 8.4% 66.7% 24.6% 0.2% 4.2% 2.3% 93.3%

40 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda FL1 FL2 FL3 FL4 FITCFITC PE ECD PC5 100%1.1%0.4%0.2% 12.3%100%12.7%4.5% 3.6%36.8%100%2.4% 1.0%9.5%36.9%100%

41 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Uncompensated vs Compensated FL1 FL2

42 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda FL1 FL2 COMPENSATION IS INTENSITY DEPENDENT uncompensatedpartially compensated fully compensated

43 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS 1. Adjust PMT voltages using unstained cells 2. Adjust compensation for each fluorochrome


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