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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudos de citocinas.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudos de citocinas."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudos de citocinas

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudos de citocinas Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica de situações patológicas de situações patológicas De estadios de situações patológicas De estadios de situações patológicas As citoquinas podem ser estudadas por: As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA) Imunoensaios (ELISA, RIA) Bioensaios Bioensaios Citometria Citometria Métodos moleculares Métodos moleculares

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de citoquinas: ELISA

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Bioensaios Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Actividade citotoxica Actividade citotoxica Proliferação Proliferação Função celular específica Função celular específica Quantidade de uma proteína induzida Quantidade de uma proteína induzida

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Activation of M in vitro +/- Cytokine secretion Remove cytokine containing supernatant Test for effect on other cells Which cytokine? Detecção de citoquinas:Bioensaios

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Include an antibody that blocks interleukin-1 Test for a characteristic effect on other cells e.g. interleukin-1 Induces proliferation in thymocytes - IL-1 present + IL-1 absent + Especificidade dos bioensaios

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Citometria de fluxo Estimular as células Estimular as células Mitogénio Mitogénio Ag+coestimuladores ( -CD28+ -CD49d) Ag+coestimuladores ( -CD28+ -CD49d) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Lisar os eritrócitos e fixar Lisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as células Permeabilizar as células Marcar com anticorpo Marcar com anticorpo Analisar Analisar

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de IFN- por citometria

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaios Moleculares

10 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes endócrinas

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Doenças Autoimunes endócrinas Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Doença de Graves Doença de Graves Diabete Melitus dependente de Insulina Diabete Melitus dependente de Insulina Doença da Addison Doença da Addison

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Doenças Autoimunes endócrinas Autoantigénios Peroxidase da Tiroide (TPO) Peroxidase da Tiroide (TPO) Antigénios Adrenais (Doença de Addison) Antigénios Adrenais (Doença de Addison) Ovario, Testiculos, Placenta Ovario, Testiculos, Placenta Antigénios da paratiróide Antigénios da paratiróide Células parietais gástricas Células parietais gástricas TSH-R TSH-R

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Diabetes Mellitus Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T Estudo da função celular T não é prática Estudo da função celular T não é prática Presença de Autoanticorpos é marcador da doença Presença de Autoanticorpos é marcador da doença Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Auto-antigénios na IDDM Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) Bandas de 64Kd e 50Kd Bandas de 64Kd e 50Kd Insulinoma Antigen (40 e 37Kd) Insulinoma Antigen (40 e 37Kd) IA-2 IA-2 GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA) Anti insulina (IAA) Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Auto-antigénios na IDDM

16 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto- anticorpos Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto- anticorpos Miastenia Gravis Miastenia Gravis Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

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22 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de doenças Auto-imunes Anemia Hemolitica Autoimune

23 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Anemias Hemoliticas autoimunes

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Anemias Hemoliticas autoimunes: Técnicas diagnósticas laboratoriais Direct Antiglobulin Test (DAT) Direct Antiglobulin Test (DAT) Demonstra o coating dos RBC com Ab in vivo Demonstra o coating dos RBC com Ab in vivo Usado para investigar : Usado para investigar : Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Hemólise induzida por drogas Hemólise induzida por drogas Doença Hemolitica do recém-nascido Doença Hemolitica do recém-nascido Reacção aloimune á transfusão Reacção aloimune á transfusão Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentes Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentes Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG sangue coag. Activ. complemento falsos positivos sangue coag. Activ. complemento falsos positivos

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda DAT: procedimento 1. Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento) 2. Preparar RBC (2-4%) em PBS 3. 1 gota RBC em 3 tubos ( IgG, C3b/C3d, e albumina como controlo) 4. Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm) 5. Adicionar 2 gotas de IgG, C3b/C3d, e 6% albumina 6. Misturar e spin IgG rpm 7. Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinação 8. Incubar 5 min-RT os restantes tubos 9. Repetir 6 e 7 para os restantes tubos 10. Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativo 11. Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Eluição de anticorpos de RBC Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos) Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos) Centrifugar Centrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC 1. Colher e manter amostra a 37ºC 2. Spin 3400rpm-1min 3. Incubar 5 a 37ºC 4. 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC 5. Agitar; incubar 1 hora a 37ºC 6. Spin rpm e examinar macroscópicamente 7. Repetir 5 e 6 a 30ºC 8. Repetir 5 e 6 a 22ºC Pos a 30 e 22ºC Ig patológicas Pos a 30 e 22ºC Ig patológicas Pos só a 22ºC Cold aglutinin Pos só a 22ºC Cold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Indirect Antiglobulin Test (IAT): (Antibody screen for RBC-Ab) Routine pre-transfusion test Routine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: 37ºC com agente enhancer* 37ºC com agente enhancer* Após adição de -IgG (reagente coombs) Após adição de -IgG (reagente coombs) Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivios devido a alo-anticorpos Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivios devido a alo-anticorpos WAIHA geralmente pan-RBC WAIHA geralmente pan-RBC * BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)

29 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de Alergias Quantificação de alergénios

30 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de Alergias Estudos in-vivo

31 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Quantificação de Alergénios Skin testing Skin testing Protein content Protein content Quantificação de alergénios individuais (RIA,ELISA, etc) Quantificação de alergénios individuais (RIA,ELISA, etc) Imunoelectroforese Imunoelectroforese PAGE PAGE Imunobloting Imunobloting Inhibition immunoassays Inhibition immunoassays

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Skin testing Para controlar a possibilidade de choque séptico Para controlar a possibilidade de choque séptico Médico disponível em SOS Médico disponível em SOS Garrote disponível em SOS Garrote disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS Seringa hipodérmica com 100 L alergénio Seringa hipodérmica com 100 L alergénio Injecção de L, cerca de 3mm diâmetro Injecção de L, cerca de 3mm diâmetro Observação aos 15 min Observação aos 15 min Medir dois diâmetros e calcular média Medir dois diâmetros e calcular média Nova observação aos 30 min Nova observação aos 30 min

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Skin testing

34 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo de Alergias Testes Laboratoriais

35 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes laboratoriais para estudo de alergias Determinação de IgE total Determinação de IgE total Determinação de IgE específica para um alergénio Determinação de IgE específica para um alergénio Screening multialergénico Screening multialergénico Imunoblotting com alergénios Imunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseiros Medida de alergénios caseiros Skin testing Skin testing

36 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

37 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Determinação de IgE total Captura com IgE conjugada com suporte sólido Captura com IgE conjugada com suporte sólido Lavar Lavar Reagir com IgE marcada Reagir com IgE marcada Lavar Lavar Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática)

38 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Determinação de IgE específica para um alergénio Alergénio ligado a matriz sólida Alergénio ligado a matriz sólida Adicionar soro doente Adicionar soro doente Incubar e lavar Incubar e lavar Reagir com IgE marcada Reagir com IgE marcada Lavar Lavar Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática)

39 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Multiple Alergen Screens Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex: Ex: Mistura de árvores Mistura de árvores Mistura de relvas Mistura de relvas Mistura de sementes Mistura de sementes Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites Pelo de cão e gato Pelo de cão e gato Etc... Etc...

40 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Specific IgE Inhibition immunoassays Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas Usar PBS como 0% inibição Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólido Alergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de IgE específica Fazer um ensaio de detecção de IgE específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor

41 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda


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